Kjøp CB1 og CB2 Online

         Kjøp CB1 og CB2 Online
KONTAKT OSS VIA;
walsomlab@gmail.com
 De cannabinoidreseptorene er en klasse av cellemembranen reseptorer under G protein-koblet reseptor superfamily.Som er typisk av G protein-koblede reseptorer, er cannabinoidreseptorer inneholde syv transmembrane spennerdomener. Cannabinoid-reseptorer aktiveres av tre store grupper av ligander, endocannabinoids (produsert avpattedyr kroppen), plante cannabinoider (som THC, produsert av cannabisplanten) og syntetiske cannabinoider (for eksempelsom HU-210). Alle endocannabinoids og plante cannabinoider er lipofile, dvs. fettløselige, forbindelser.Det er i dag to kjente undertyper, kalt CB1 og CB2. CB1 reseptoren uttrykkes hovedsakelig i hjernen(Sentralnervesystemet eller "CNS"), men også i lunger, lever og nyrer. Den CB2 reseptoren uttrykkes hovedsakligi immunsystemet og på hematopoietiske celler Montering bevis tyder på at det er nye cannabinoidreseptorer som er, ikke-CB1 og ikke-CB2, som uttrykkes på endotel-celler, og i CNS. I 2007, denbinding av flere cannabinoider til en G-protein-koblet reseptor (GPCR) i hjernen ble beskrevet.Protein sekvenser av CB1 og CB2 reseptorene er ca 44% like. Når bare transmembrane regioner avreseptorer vurderes, er aminosyre likhet mellom de to reseptorsubtyper ca 68%. IDessuten har mindre variasjoner i hver reseptor blitt identifisert. Cannabinoider binde reversibelt og stereo-selektivt til cannabinoidreseptorer. Affiniteten til et individ cannabinoid til hver reseptor bestemmerVirkningen av at kannabinoid. Cannabinoider som binder mer selektivt til visse reseptorer er mer ønskelig for medisinsk bruk.



KONTAKT OSS VIA; walsomlab@gmail.com

 

 CB1Cannabinoid reseptor type 1 (CB1) reseptorer er antatt å være en av de mest utbredte uttrykt G protein-kobledereseptorer i hjernen. Dette skyldes endocannabinoide-mediert depolarisering-indusert undertrykkelse av hemming, enmeget vanlig form for kortvarig plastisitet hvori depolarisering av en enkelt neuron induserer en reduksjon iGABA-mediert neurotransmission. Endocannabinoids løslatt fra depolarized post-synaptiske nervecellen binder seg til CB1reseptorer i den presynaptiske nervecellen og føre til en reduksjon i GABA utgivelse.De finnes også i andre deler av kroppen. For eksempel, i leveren, er aktivering av CB 1-reseptoren kjentå øke de novo lipogenesis. Aktivering av presynaptiske CB1 reseptorer er også kjent for å hemme sympatiskinnervasjon av blodkar og bidrar til undertrykkelsen av neurogen vasopressor respons i septiskstøt.

KONTAKT OSS VIA; walsomlab@gmail.com
 
 En studie gjort på CB1 knockout mus (genetisk endrede musene som ikke kan produsere CB1) viste en økning idødelighet. De har også vist undertrykt bevegelsesaktiviteten samt hypoalgesia (redusert smertefølsomhet). De CB1 knockout mus reagerte på delta9-tetrahydrocannabinol THC. Dette viser at enten eller CB2ukjente cannabinoidreseptorer har også farmakologisk betydning.CB2Utdypende artikkel: Cannabinoid reseptor type 2CB2-reseptorer er hovedsakelig uttrykt på T-celler i immunsystemet, på makrofager og B-celler, og iblodkreft cellene. De har også en funksjon i keratinocytter, og er uttrykt på mus pre-implantationembryoer. De er også uttrykt på perifere nerve terminaler. Disse reseptorene spille en rolle i antinociception, ellerlindring av smerte. I hjernen er de i hovedsak uttrykt av mikrogliale cellene, hvor deres rolle er fortsatt uklar.Mens de mest sannsynlige cellulære mål og testamentfullbyrdere av CB2 reseptor-medierte effekter av endocannabinoids ellersyntetiske agonister er immun og immun-avledet celler (f.eks leukocytter, ulike populasjoner av T og Blymfocytter, monocytter / makrofager, dendrittiske celler, mastceller, microglia i hjernen, Kupffer celler ilever, osv.), er antallet av andre potensielle cellulære mål ekspanderer, nå inkludert endotelceller og glattemuskelceller, fibroblaster av forskjellig opprinnelse, cardiomyocytes, og visse neuronale elementer av det perifere ellersentrale nervesystem. 

KONTAKT OSS VIA; walsomlab@gmail.com

 

 



 AbstraktLeddsmerter er en vanlig klinisk problem som både inflammatoriske og degenerative leddsykdommer er storårsaker. Hensikten med denne studien var å undersøke hvilken rolle CB1 og CB2 cannabinoidreseptorene iatferdsmessige, histologisk, og nevrokjemiske endringer i forbindelse med leddsmerter. Den murine modell av monosodiumjodacetat (MIA) ble brukt til å indusere leddsmerter i knockout mus for CB1 (CB1KO) og CB2 cannabinoidreseptorene(CB2KO) og transgene mus overekspresjon CB2 reseptorene (CB2xP). I tillegg har vi vurdert de endringer indusert avMIA i genuttrykk av CB1 og CB2 cannabinoidreseptorene og μ-, δ-og κ-opioide reseptorer i korsryggen spinalledning av disse musene. Villtype mus, samt CB1KO, CB2KO, og CB2xP mus, utviklet mekanisk allodyni iipsilaterale pote etter MIA intraartikulær injeksjon. CB1KO og CB2KO viste tilsvarende nivåer av mekaniskallodyni av den som ble observert i vill-type mus i den ipsilaterale pote, mens allodyni ble betydelig svekketi CB2xP. Interessant, vises CB2KO en kontralateral speilbilde av smerte utvikle mekanisk allodynia ogsåi kontralaterale labben. Alle mus linjer utviklet lignende histologiske endringer etter MIA intraartikulærinjeksjon. Likevel produsert MIA intraartikulær injeksjon spesifikke endringer i ekspresjonen av cannabinoidog opioid reseptor gener i ryggmargen seksjoner som ble ytterligere modulert ved genetisk endring avcannabinoidreseptoren system. Disse resultatene viste at CB2 reseptoren spiller en dominerende rolle i kontrollenav leddsmerter manifestasjoner og er involvert i de adaptive endringer indusert i opioid systemet under denne smertentilstand.Karakterisering av indre og ytre faktorer som regulerer self-renewal/division og differensiering avstamceller er avgjørende for embryonale stamceller (ES) celle skjebne. ES-celler differensieres til flereblodkreft linjene under embryoid kroppen (EB) dannelse in vitro, som gir en eksperimentell plattform for ådefinere de molekylære mekanismene som kontrollerer bakterie lag skjebne besluttsomhet og vev formasjon.Metoder og resultaterDen cannabinoid reseptor type 1 (CB1), og cannabinoidreseptor type 2 (CB2) er medlemmer av den G-protein kobletreseptor (GPCR) familie, som aktiveres av endogene ligander, de endocannabinoids.CB1 reseptor uttrykk errikelig i hjernen mens CB2 reseptorene er mest uttrykt i blodkreft cellene. Med uttrykket og denpresise roller CB1 og CB2 og deres beslektede ligander i ES-celler er ikke kjent. Vi observerte signifikant induksjonav CB1 og CB2 cannabinoidreseptorene løpet av blodkreft differensiering av murine ES (MES)-avledet embryoidorganer. Videre MES celler samt ES-deriverte embryoid organer på dager 7 og 14, uttrykt endocannabinoids,de ligander for både CB1 og CB2. CB1 og CB2 antagonister (AM251 og AM630, henholdsvis) indusert MES celledød, sterkt antyder at endocannabinoids er involvert i overlevelse av MES celler.Behandling av MES cellermed eksogene cannabinoid ligand Δ9-THC resulterte i økt blodkreft differensiering av MES celler,mens tillegg av AM251 eller AM630 blokkert embryoid kroppen dannelsen avledet fra MES celler. I tilleggcannabinoid reseptoragonister induserte kjemotaksen av ES-avledet embryoid organer, som ble spesifikt inhibert av denCB1 og CB2 antagonister.KonklusjonerDette arbeidet har ikke blitt behandlet tidligere, og gir ny informasjon om funksjonen til cannabinoidreseptorene,CB1 og CB2, som komponenter i en ny vei å regulere murine ES-celle-differensiering.Denne studien girinnsikt i cannabinoidsystemet engasjement i ES celle overlevelse og blodkreft differensiering.InnledningMurine embryonale stamceller (MES) celler, avledet fra den indre celle massen av preimplanted embryoer, er pluripotente ogbeholde evnen til å differensiere til cellene i alle tre bakterie lag av den tredje museembryo.Forstå det regulatoriske mekanismer ansvarlig for blodkreft differensiering av MES celler er avgjørendei å definere stier og molekylære hendelser som styrer bakterie lag besluttsomhet og vev formasjon.ES-celler utviser også kapasitet til å bidra til et bredt spekter av veldefinerte celletyper ved bruk av flere ivitro modeller for differensiering. In vitro-analyser ved hjelp av differensiering ES kulturer medføre fjerning av leukemiinhiberende faktor (LIF) og separering av cellene fra materen sjikt under betingelser som fremmerdannelsen av embryonale stamceller aggregater, kalt embryoid organer (EBS). Disse EBS inneholde en rekke ulikecelletyper. Molekylære analyser i kombinasjon med in vitro differensiering analyser av ES-celler giinnsikt i de tidlige molekylære hendelser assosiert med avstamning spesifikasjon.Selv om in vitro hematopoietisk differensiering av ES-celler har blitt karakterisert, både cellulære ogmolekylære nivåer, de veier som regulerer blodkreft differensiering av ES-celler er ikke godt definert. ES-celler kan utvides ex vivo som udifferensierte celler som beholder en normal karyotype eller,Alternativt, kan bli differensiert ex vivo i celletyper av alle tre lag bakterie [2]. LIF er nødvendig for åopprettholde den udifferensierte tilstand av ES-celler, mens tilbaketrekking av LIF initierer dannelsen av EBScellulær differensiering [3], [4]. Selv om EBS er langt mindre organisert enn selve embryo, kan dedelvis etterligner den romlige organiseringen i embryo. Utviklingsmessige mekanismer for vaskulær og blodkreftsystemer i EBS er lik de i plommesekken.G-koblede protein reseptor (GPCR) medlemmer spiller en sentral rolle i å regulere den romlige fordelingen av umodenog modne blodkreft celler, inkludert deres slipper inn i sirkulasjon og homing til blodkreft vev.GPCRs har vært knyttet til mange funksjoner, inkludert cellevekst, modning, overlevelse, apoptose, ogmigrasjon [9] - [12]. CB1 og CB2 cannabinoidreseptorene er medlemmer av GPCR familien. De CB2 reseptorene erførst og fremst uttrykt i myelogen, makrofag, erythroid, lymfoid og mastceller [13].Hjernen cannabinoidreseptorCB1 kommer også til uttrykk i blodkreft cellene som lymfocytter, splenocytes og T-celler, men det meste CB1 reseptoreruttrykkes ved høye nivåer i det sentrale nervesystemet (CNS) hvor de regulere dempningen av synaptiskeoverføring og psychoactivity [14] - [20]. Hittil er flere endogene lipider som er derivater av langkjededefettsyrene er blitt isolert og karakterisert som naturlige ligander, og er betegnet endocannabinoids.Endocannabinoids er syntetisert in vivo ved ulike vev på etterspørselen gjennom spalting av membran forløpere, oger involvert i kortdistanse signalisering prosesser [21]. Fire typer av endogene forbindelser som er funnet tillangt og blitt foreslått å fungere som endocannabinoids: 1) Anandamid (AEA) (N-arachidonoyl-ethanolamine) og noen av detsderivater, 2) 2-arachidonoylglycerol (2-AG) og noladin eter (2-arachidonoyl glycerol-eter), 3) virodhamine(O-arachidonoyl-etanolamin), og 4) N-arachidonoyl-dopamin (NADA). Siden oppdagelsen sin, endocannabinoids,Anandamid og 2-AG i særdeleshet, har vært innblandet i fysiologiske funksjoner, så vel som i mange patologiskeforhold. Endocannabinoids har vært isolert fra hjernen så vel som fra milten og annet periferiutstyrvev [21]. Tilstedeværelsen av endocannabinoids i blodkreft og immunceller antyder at CB2 og detsendogene ligander kan spille viktige fysiologiske roller i reguleringen av betennelsesreaksjoner og immunsvar [22]. Med uttrykket, funksjon og den nøyaktige roller CB1 og CB2, så vel som deres kognatligander, i ES-celler er ikke kjent.Naturlige cannabinoider er bestanddeler av marihuana planter [23]. Δ9-tetrahydrocannabinol (= THC), et stortpsykoaktive bestanddel av marihuana, samhandler med både CB1 og CB2 reseptorene, og dermed få fram en rekkeav farmakologiske responser in vitro og in vivo [24]. Mange agonister har blitt utviklet som er selektive forCB1 (ACPA, ACEA) og CB2 (JWH-015, JWH-133) reseptorer og har betydelig høyere affinitet for en reseptorover den andre [24] - [29]. Videre vil diverse antagonister som spesifikt hemmer de CB1 eller CB2 reseptorene harogså blitt utviklet. Anandamid og 2-AG er endogene ligander, medlemmer av eicosanoid klasse av cannabinoider,som er arakidonsyre derivater og er strukturelt forskjellige fra andre cannabinoidtester klasser.Vi hypotese at CB1 og CB2 spille regulatoriske roller i blodkreft differensiering av ES-celler og atendocannabinoids er viktig for overlevelsen av ES-celler. Her undersøkte vi uttrykk og funksjon av CB1og CB2 i MES celler og bestemt sin rolle i MES celle blodkreft differensiering. Vi har også analysertuttrykk for endocannabinoids i MES celler og bestemmes effekten av cannabinoidtester antagonister på ES cell

KONTAKT OSS VIA; walsomlab@gmail.com

 
overlevelse.ResultaterExpression of CB1 og CB2 i murine embryonale stamceller og murine embryoid organerFor å undersøke uttrykket av CB1 og CB2 i MES celler, utførte vi RT-PCR-analyse på kontroll udifferensiert ESceller (Rosa26.6 og E14 ES-celler) og på EBS avledet fra det sekundære blodkreft differensiering av disse toES cellelinjer på ulike tidspunkt som angitt. Vi fant ut at CB1 og CB2 mRNA og proteiner ble indusertvesentlig i hematopoetiske differensiert EBS som sammenlignet med kontroll ES-celler. Som vist i figur 1A og B, etsignifikant induksjon av CB1 og CB2 genuttrykk ble observert i dag 8 og dag 11 blodkreft EBS fra bådeRosa26.6 og E14 ES-celler, mens udifferensierte MES celler hadde lite uttrykk for CB1 og CB2. Interessant,ekspresjon av CXCR4 (et medlem av familien GPCR) ble observert i udifferensierte ES-celler, og ble ikke forandretunder ES celledifferensiering (Fig. 1A). Vi har også analysert flere blodkreft markører i disse blodkreftEBS. Vi har observert induksjon av SCA-1 ekspresjon, så vel som induksjon av PECAM-1-og Flk-1-ekspresjon i løpet av ES cellendifferensiering (Fig. 1C), noe som er i overensstemmelse med andre publiserte rapporter [30].Deretter ble CB1 og CB2 protein uttrykk analysert i Rosa26.6 og E14 ES-celler ved Western blot analyser ved hjelp av toforskjellige spesifikke sett av CB1 og CB2 antistoffer, kommersielt tilgjengelig fra Chemicon (sett 1) ​​(fig. 2) og Sigma(Sett 2) (data ikke vist). Begge sett med spesifikke CB1 og CB2 antistoffer viste induksjon av CB1 og CB2 proteinuttrykk under ES celledifferensiering i dag 8 og 11 EBS avledet fra videregående differensiering, somdemonstrert ved Western blot-analyse (fig. 2) og immunhistokjemi (data ikke vist).Disse resultatene viste atCB1 og CB2 er både oppregulert i løpet av blodkreft differensiering av ES-celler og innebærer at CB1 og CB2kan ha viktige regulatoriske roller i ES celledifferensiering.Uttrykk for endocannabinoids i MES celler og embryoid organer avledet fra MES celler på dager 7 og 14For å undersøke om MES celler samt EBS avledet fra MES celler uttrykker endocannabinoids, var Mes celleranalysert for ekspresjon av forskjellige fettsyrer og deres ethanolamide og monoglycerid-derivater ved hjelp av LC-APCI-MS analyse [31]. Som vist i figur 3 ble det avledningene av de endocannabinoids detektert og kvantifisert iMes celler og EBS på dager 7 og 14. Nivået på Anandamid (AEA) uttrykk i MES cellene var mye lavere somsammenlignet med den til to-AG, og AEA ble ikke påvist i det hele tatt i EBS på dagene 7 og 14. Uttrykket nivåer av: 2-AG,dokosaheksaensyre (DHA), arakidonsyre (AA), 2-oleoyl glyserol (2-OG), eikosapentaensyre (EPA), 2 -docosahexaenoyl glyserol (2-DHG) og 2-eicosapentaenoyl glyserol (2-EPG), var rikelig i MES celler, og EBS på7 og 14 dager. Endocannabinoide nivåer i embryonale stamceller ble korrelert til antall MES-celler (dataikke vist). Disse analysene viste at MES celler rikelig uttrykke endocannabinoids, spesielt 2-AG som kanskjevære viktig for å overleve. Videre, ettersom både EBS på dager 7 og 14 ekspress endocannabinoids, dette kunnetyder på at endocannabinoids kan spille en rolle i blodkreft differensiering av MES celler.Effekter av eksogene og endogene cannabinoid ligander på kjemotakse av MES cellerEn viktig funksjon av 2-AG endocannabinoide er stimulering av migrasjon i B-lymfocytter [32]. Siden CXCR4 ogkognatreseptoren ligand SDF-1α er involvert i stamcelletransplantasjon kjemotaksis, migrasjon og homing [33] - [45], ogsiden CXCR4, CB1 og CB2 er medlemmer av GPCR familien, vi derfor undersøkt om cannabinoidtester ligander fungere somkjemotaktiske eller chemokinetic agenter for ES-celler. Vi analyserte virkningen av den endogene ligand cannabinoid 2-AG,det eksogene ligand Δ9-THC og den spesifikke CB2 reseptoragonist, JWH-015, på kjemotakse av udifferensiertES-celler samt dag 10 EBS avledet fra videregående blodkreft differensiering.De kjemotaksen analysene ble utført ved hjelp Costar Transwells (Corning-Costar, Cambridge, MA). Som vist i figur 4,kjemotaksis ble observert med differensiert EBS på dag 10 i nærvær av Δ9-THC, 2-AG og JWH-015cannabinoid ligander, mens den kjemotaksen av udifferensierte ES-celler var svært lav.Dette kjemotakse ble hemmetav CB1 og CB2 spesifikke hemmere, AM251 og AM630, henholdsvis. Således, cannabinoid-ligander, slik som 2-AG,eksogene Δ9-THC og JWH-015 indusere chemotaxis av blodkreft differensierte ES-deriverte EB celler, mediertgjennom begge CB1 og CB2-reseptorer.Effekter av cannabinoid hemmere på overlevelsen av Rosa ES-cellerFor å analysere virkningene av Δ9-THC på overlevelse av Rosa ES-celler, var Rosa ES-celler ubehandlet eller behandlet medΔ9-THC (1 uM), eller med de spesifikke inhibitorer for CB1 (AM251) CB2 eller (AM630) (i fravær av Δ9-THC) i 48timer. I tillegg ble Rosa ES-celler behandlet med DMSO (0,01%) eller med metanol (0,01%) som kjøretøyets betjeningsinnretninger.Etter 48 timer ble cellene analysert for levedyktighet. Som vist i figur 5, var det ingen effekter på Rosa ES cellelevedyktighetobservert etter behandling med DMSO eller metanol i forhold til cannabinoid-behandlede ES-celler. Δ9-THC også hadde ingenapoptotiske effekter på Rosa ES-celler. Men indusert begge hemmere (AM251 og AM630) betydelig celledødi fravær av Δ9-THC (fig. 5). Disse resultatene antyder at endocannabinoids, enten utskilles av ES-celler og / ellerav den primære embryonale fibroblast (PEF) mater celler, er viktig for overlevelsen av ES-celler og atspesifikke hemming av disse endogene ligander av hemmere for CB1 og CB2 resultater i celle apoptose.Effekter av endocannabinoids og eksogene cannabinoidtester ligander på differensiering av MES cellerFor å undersøke effekten av eksogene cannabinoidtester ligander på ES celledifferensiering, den ligand Δ9-THC (1 mikrometer) varlagt til Rosa ES-celler i DMEM medium. CB1 spesifikk hemmer AM251 (1 mikrometer) og CB2 spesifikk hemmer AM630(1 pM) ble anvendt for å blokkere virkningene av cannabinoid-ligander på ES celle differensiering, som angitt. Dentilsetning av AM251 eller AM630 eller tilsetning av kontrollen kjøretøy DMSO (0,01%) eller metanol (0,01%) ble utført i løpetden primære differensiering scenen og videregående blodkreft differensiering av Rosa ES-celler i EBS. ES-cellerble forinkubert med AM251 eller AM630 eller med kontroll kjøretøy DMSO eller metanol i 30 min. Cellene ble derettervasket og videre kultivert for in vitro differensiering hematopoietisk over 14 dager i nærvær eller fraværav Δ9-THC, som beskrevet ovenfor. Antallet EBS ble tellet etter 14 dager. Som vist i figur 6, Δ9-THC induserte enøkning i antall EBS sammenlignet med kontrollprøvene ES-celler. Men når Δ9-THC ble administrertnærvær av AM251 eller AM630, var det en nedgang i antall EBS (opptil 70-75% hemming). Interessant,AM251 eller AM630 alene hemmet også antallet EBS avledet fra ES-celler (fig. 6).Dette resultatet tyder på atDisse hemmere blokkerer virkningene på ES-celle-avledet EBS som medieres av den endogene endocannabinoidligander, utskilles av enten ES-celler eller PEF mater celler, og at hemming av CB1 og / eller CB2 reseptoren-medierte effekter, etter spesifikke CB1 og CB2 hemmere, betydelig blokker EB formasjon.DiskusjonNyere arbeider har knyttet endringer i immunforsvaret til biologisk og terapeutisk målretting av cannabinoidreseptorene[13]. Cannabinoidreseptor uttrykk tilbyr et nytt prinsipp for regional immune homeostase og sykdommottakelighet, og utvider og foredler begrunnelsen for CB2-målrettet immunterapi i immunsystemet og inflammatorisksykdommer. Derfor klarlegging av virkningene av cannabinoidsystemet (spesielt CB2-transduserte signalering) påstamcelleforskningen selvfornyelse, spredning og differensiering skal føre til etablering av nye terapeutisketilnærminger for hematologiske lidelser samt nye strategier som involverer farmakologisk støtte forstamcelletransplantasjon (HSC)-baserte terapier.Her har vi karakterisert ekspresjon og funksjon av CB1 og CB2 cannabinoide reseptorer på murine ES-celler ogi ES-avledet EBS, og undersøkt hvilken rolle endocannabinoids og deres beslektede reseptorer, CB1 og CB2, som romankomponentene i en ny vei viktig i murine ES celle differensiering. For å teste hypotesen om at CB1 ogCB2 reseptorene kan ha komplementære roller i blodkreft differensiering av ES-celler, benyttet vi ES-avledetdifferensiering metoder ved hjelp av den embryoid Body analysen, som er godt kontrollert, lett manipulert ogfysiologisk representative for in vivo-system. Vi viste signifikant oppregulering av CB1 og CB2 mRNAog protein i blodkreft EBS på dager 8 og 11 i begge Rosa26.6 ES-celler og E14 celler.Cannabinoidsystemet agonistΔ9-THC og endocannabinoids indusert kjemotakse av EBS stammer enten fra Rosa26.6 eller E14 celler på dag 10.Behandling av MES celler med CB1 cannabinoid antagonist AM251 eller med CB2 cannabinoid antagonist AM630 resultertei døden av disse cellene, noe som indikerer involvering av endocannabinoids i MES celle overlevelse. Murine ES cellerble funnet å rikelig uttrykke endocannabinoids inkludert endocannabinoid 2-AG, som kan spille en rolle i MEScelle overlevelse. Videre EBS på dager 7 og 14 uttrykker også endocannabinoids, noe som tyder på at endocannabinoidsmediere differensiering av hematopoetiske celler mes, ettersom antallet EBS avledet fra MES cellene varhemmet i nærvær av AM251 og AM630. Disse resultatene viser at både CB1 og CB2-reseptorer, så vel som deresbeslektede agonister, er viktige regulatorer av MES celle overlevelse og differensiering.Tilgjengeligheten av stamceller gir nye tilnærminger for behandling av menneskelige sykdommer. Klarlegging avregulatoriske mekanismene som er ansvarlig for stamcelleforskningen differensiering er avgjørende for anvendelsen av ES-celler til menneskesykdommer [46]. Mus ES-celler gjennomgår ubegrenset selv-fornyelse i nærvær av cytokinet LIF, og samtidig beholdederes multi-avstamning differensiering kapasitet. Tilbaketrekking av LIF og aggregering av cellene føre tildifferensiering av strukturer som kalles embryoid organer (EBS). Under differensiering, er visse gener oppregulertog flere andre er nedregulert i en intrikat kontrollert måte.Ved hver ES celledeling, er den alternative utfall av gjennomgår selv-fornyelse eller differensiering bestemmes avsamspill mellom iboende faktorer og ytre eller selektiv signaler. Men til dags dato den iboende biologidisse ES-celler forblir dårlig definert. Stimulering av ES celle selvfornyelse ble funnet å være begrenset til LIFog beslektede cytokiner av IL-6-familien, hvilket signal via gp130 reseptoren via JAK kinase-mediert STAT3aktivering [46] - [48]. PI3-kinase signalisering ble også observert å spille en viktig rolle i MES celle overlevelse ogcellesyklusprogresjon [49]. Nylig ble STAT3 rapportert å være nøkkelen nedstrøms transkripsjonsfaktor av 


KONTAKT OSS VIA; walsomlab@gmail.com

 LIF/gp130 signalveien i Mes celler. Videre har det Ca2 +-signalveien i MES-celler ble også vist åmegle MES celle funksjon [50]. Basert på våre resultater, foreslår vi at cannabinoidsystemet er en ekstrasti involvert i MES celle overlevelse og differensiering.Flertallet av rettede differensiering protokoller utnytte en første EB aggregering trinn.Derfor, tidlig-konstituert differensiering-fremme aktiviteter som skjer inne i EBS er i stor grad ukjent.Basert på våre resultater, vityder på at eksogene cannabinoider kan indusere eller fremme blodkreft differensiering. Mes celler uttrykker både CB1og CB2 reseptorene og begge reseptorer er funksjonelle. Tilsetting av eksogene selektive cannabinoidtester agonister utvidetden embryoid kroppen dannelsen avledet fra MES celler, noe som indikerer at cannabinoid ligander indusert blodkreftdifferensiering av MES celler gjennom CB1 og CB2 i både MES celler og EB-avledet Mes celler. Interessant, CB2reseptorer ble nylig funnet å fremme mus nevrale stamceller spredning (NSCP) [47].Cannabinoidtester agonisterogså økt in vitro NSCP spredning og neurosphere generasjon [47]. Bidraget av endocannabinoids tilneurogenesis innenfor subventricular sonen ble anerkjent på grunn av redusert spredning av nevrale forløpere iCB1 reseptor knockout mus [47]. Dermed disse observasjonene sammen med våre resultater sterkeste at både CB1og CB2 aktivering er involvert i vedlikehold av MES celler og at endocannabinoid systemet er viktig istamcelletransplantasjon overlevelse og stamcelle blodkreft differensiering.Materialer og MetoderAntistoffer, og kjemiske og biologiske stofferAnti-CB1 og anti-CB2 antistoffer (ABR-Affinity BioReagents, Golden, CO) ble brukt til farging. Denimmunophenotyping av CB2 ble bekreftet ved bruk av en annen anti-CB2-antistoff oppnådd fra Sigma (St. Louis,MO). De cannabinoidtester ligander Δ9-THC (THC), JWH133, methanandamide, og CP55940 ble også innhentet fra Sigma. ACEAog cannabinoidreseptoren antagonister AM251 og AM630 ble kjøpt fra TOCRIS (Ellisville, MO). G-CSF(Neupogen) ble innhentet fra Amgen Inc. (Thousand Oaks, CA). MethoCult 03434 (for mus celler) ble innhentet fraStemCell Technologies (Vancouver, BC, Canada). De deuterierte endocannabinoids brukes som interne standarder iLC-APCI-MS analyse ble syntetisert i huset ved Center for Drug Discovery, Northeastern University (Boston,MA) etter rapporterte metoder [31].RT-PCR analyse av CB1 og CB2 uttrykkRNA fra total MES celler ble ekstrahert ved hjelp RNeasy Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA) etterprodusentens protokoll. En QIAshredder spin kolonne og DNase fordøyelsen ble inkludert i isolasjon prosedyre for åbegrense muligheten for PCR-amplifikasjon av CB1 og CB2 fra genomisk DNA. cDNA og PCR forsterkning varutført med BD Biosciences TITANIUM One-Step RT-PCR Kit med 200 ng av RNA som en mal for første-strandsyntese. CB1 ble forsterket ved hjelp av primere: 5'-CGT GGG CAG CCT GTT CCT CA-3 'og 5'-CAT GCG GGC TTG GTC TGG-3', somgi et produkt av 403 bp. CB2 ble forsterket ved hjelp av: 5'-CCG GAA AAG AGG ATG GCA ATG AAT-3 'og 5-CTG CTG AGC GCC CTGGAG AAC-3 ', noe som gir et produkt av 479 bp. GAPDH ble brukt som positiv kontroll med primere: 5'-CTC ACT GGC ATGGCC TTC CG-3 'og 5'-ACC ACC CTG TTG TAG CTG CC-3', noe som gir et produkt av 292 bp. Malen var først denaturertved 94 ° C i 2 minutter etterfulgt av 35 sykluser (94 ° C i 30 sek, 58 ° C i 30 sek og 68 ° C i 1 min), etterfulgt av 68 ° C i2 min i en myCycler Personlig termosykler (Bio-Rad Laboratories, Inc). Aliquoter (20 ml) av PCR-produktene varløpe på en 1,2% agarosegel inneholdende 0,5 mg / ml etidiumbromid.Originering av embryoid organer fra ES-cellerDen Rosa26.6 ES cellelinje ble innhentet fra Dr. Stuart Orkin (Barnas Hospital, Harvard Medical School), The E14og GFP-E14 cellelinjer ble hentet fra Dr. Bing Lim (Beth Israel Medical Center diakonale, Boston). Kultur ogvedlikehold av ES-celler i en udifferensiert tilstand ble utført som beskrevet tidligere [1].Kort, ES-cellerble opprettholdt på en mus PEF mater cellelinje i ES medium som inneholder Dulbecco modifiserte Eagle medium (DMEM)med høy glukose, 10 ng / ml murine leukemi hemmende faktor (mLIF; Chemicon International, Temecula, CA), 15%føtalt kalveserum (FCS, Hyclone, Logan, UT), 1 mM natrium-pyruvat, 2 mM glutamin, 0,1 mM unødvendig aminosyre,100 mM monotioglycerol (MTG, Sigma), 50 U / ml penicillin og 10 ug / ml streptomycin.ES cellelinjer varjevnlig analysert, ved hjelp av en ES celle karakterisering kit (Chemicon), for bestemmelse av alkalisk fosfataseaktivitet og deteksjon av overflate markører og transkripsjonsfaktorer som er uttrykt av udifferensiert ESceller, for eksempel Oct-4, Rex-1, SSEA-1 og Genesis (Fox D-3).In vitro hematopoietisk differensiering av ES-celler ble utført som beskrevet, i det vesentlige ifølgeprotokoll av StemCell Technologies. Den embryoid kroppen (EB)-metoden omfatter to trinn: først, sfærisk celleaggregater (kalt embryoid organer = EBS) genereres som inneholder ectodermal, mesodermal og endodermalderivater (= Primary Differensiering), andre er disse aggregatene valgt for blodkreft forløpere ogutvidet med vekstfaktorer som IL-3 og IL-6 (= Sekundær Hematopoietiske Differensiering). Kort fortalt var EBSgenerert på en% metylcellulose kulturer (1 × 104 ES-celler per 35-mm petriskål). Å fremme primære differensieringi EBS, ble ES-celler dyrket i ES differensiering medium som inneholder Iscoves modifisert Dulbeccos medium(IMDM), 15% FCS (StemCell Technologies), 2 mM glutamin, 150 mM MTG, og 40 ng / ml murin stamcelle faktor (mscf).Etter åtte dager med differensiering, ble EBS samlet inn og vasket. 1 x 104 av enkelt-celler ble utsådd på 1%methylcellulose fra det sekundære blodkreft differensiering medium. 15% FBS, 2 mM L-glutamat, 150 uM MTG, 20%BIT (10% BSA, 10 ug / ml insulin, 200 pg / ml transferrin), 150 ng / ml mscf, 30 ug / ml IL-3, 30 ug / ml IL-6 og 3 U / ml EPOble tilsatt til kulturen for å fremme hematopoietisk differensiering. Celler ble behandlet for Wright-Giemsafarging, RT-PCR og Western blot analyser på ulike tider av EB kultur differensiering, som angitt.For å bestemme egenskapene til ulike typer blodkreft stamceller stede under ES celldifferensiering, ble EBS fra ES cellelinjer samlet inn fra de kulturene på dager 8 og 11 (fra den dagenreplating) for å få blodkreft stamceller. Cytospin utarbeidelse av disse cellene ble farget med Wright-Giemsa og undersøkt under et lysmikroskop. Udifferensierte ES-celler har en stor kjerne, minimal cytoplasmaog ett eller flere fremtredende mørk nucleoli. Blodkreft stamceller som finnes i EB-dag 14 kulturer ble identifisert vedmorfologi av erythroids, megakaryocytes, monocytter / makrofager, granulocytter og mastceller, som analyseres av felt mikroskopi. 

KONTAKT OSS VIA; walsomlab@gmail.com

 


 Kjemotaksis analyserDe kjemotaksen ble-utført ved å bruke 5-mikrometer porestørrelse og 6,5 mm diameter Costar Transwells (Corning Costar-,Cambridge, MA), som tidligere beskrevet [30]. Celler ble vasket to ganger med Hanks balanserte saltløsning (HBSS)medium, resuspendert i 100 ul medium [Iscoves Modified Dulbeccos Medium (IMDM) pluss 0,5% BSA] og plassert iøvre kammer av Transwells. I det nedre kammer, ble 600 ul av medium med eller uten ligand plasseres såangitt. Etter 4 timers inkubering ved 37 ° C og 5% CO2, ble det øvre kammer fjernet og antallet migrerteceller ble bestemt ved hjelp av en CASY / TTC celle teller. Ligand Δ9-THC (Δ9-tetrahydrocannabinol) og den endogeneligand 2-AG (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI, Catalog # 62165) ble lagt på en mikrometer konsentrasjoner i IMDM media. Denspesifikke CB2 reseptoragonist JWH-015 (TOCRIS Catalog nummer # 1341) ble også testet på en 1 mikrometer konsentrasjon. DenCB1 spesifikk hemmer AM251 (1 mikrometer) (TOCRIS Catalog nummer # 1117) og CB2 spesifikk hemmer AM630 (1 mikrometer)(TOCRIS Catalog nummer # 1120) ble brukt for å blokkere effekten av cannabinoidtester ligander på ES cell kjemotaksis. For deninhiberings-studiene ble cellene preinkubert med inhibitoren agonister i 30 min som angitt. SDF-1 alfa (25ng / ml) ble anvendt som en positiv kontroll (PeproTech Inc., katalog nummer # 250-20A).Overlevelse analyser2 x 104 ES-celler (Rosa per brønn av 96 brønner), CB1 og CB2 spesifikke ligander så vel som inhibitorer ble tilsatt tilcellekultur som angitt. En 1 mM endelig konsentrasjon ble brukt for CP55940 (CB1 og CB2-agonister), ACEA (CB1ligand) og JWH133 (CB2 ligand). A 1 pM endelig konsentrasjon av både AM251 (CB1 inhibitor) og AM630 (CB2 inhibitor)ble anvendt, som angitt. Celler ble inkubert i to dager i en fuktet CO2-atmosfære. MTT analysen varutført i henhold til manualen Promega (Promega Cat # G5421), og absorbansen ved 490 nm ble deretter registrert.Endocannabinoid nivåer i embryonale stamcellerUtvinning prosedyre for de kalibreringsstandarder ble utført som beskrevet [31]. Celler (MES celler, EBS pådag 7 og EBS ved dag 14), i forskjellige konsentrasjoner som angitt, ble homogenisert i kald aceton: PBS, pH 7,4(31). Homogenatene ble sonikert i 30 sekunder før sentrifugering ved 20 800 g i 5 minutter. Acetonetfra de resulterende supernatantene ble fjernet under nitrogen. Til den gjenværende supernatant, 50 ul PBS, en volumdelmetanol og to volumer av kloroform ble tilsatt for væske-væske-fase ekstraksjon av lipider. De to faseneble separert ved sentrifugering, og den nedre organiske fase ble inndampet under nitrogen. De celleprøver varrekonstituert i 50 mL etanol.Systemet brukes til analyse var en TSQ Quantum Ultra trippel kvadrupol massespektrometer (Thermo Electron, SanJose, California) med en Agilent 1100 HPLC på fronten (Agilent Technologies, Wilmington, DE). Den mobile fase 

KONTAKT OSS VIA; walsomlab@gmail.com
 
 besto av 10 mM ammoniumacetat (pH 7,3 ved hjelp av ammoniumhydroksyd A) og 100% metanol (B). Separasjon av hvertanalytt ble oppnådd ved hjelp av en Zorbax SB-CN 2,1 × 50mm, 5 mikrometer, 80a, kolonne (Agilent Technologies) og gradienteluering;den autosampler ble holdt ved 4 ° C for å unngå nedbrytning analytten. Eluerte toppene var ionisert via atmosfæriskpress kjemisk ionisering (APCI) og oppdaget av hver analytt i SRM overgang.Statistisk analyseResultatene er presentert som gjennomsnitt ± S.D. Betydningen av dataene ble bestemt av en tosidig t-test.P <0,05 ble ansett som statistisk signifikant.Kilde, grafer og figurer: uttrykk og funksjon av cannabinoidreseptorene CB1 og CB2 og deres kognatCannabinoidtester Ligander i Murine embryonale stamceller