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I recettori cannabinoidi sono una classe di recettori di membrana cellulare sotto il G superfamiglia recettore accoppiato a proteina.Come è tipico di G recettori accoppiati alla proteina, i recettori dei cannabinoidi contengono sette transmembrana spanningdomini. Recettori cannabinoidi sono attivati ​​da tre gruppi principali di ligandi endocannabinoidi, (prodotto dallacorpo di mammifero), cannabinoidi vegetali (come il THC, prodotto dalla pianta di cannabis) e cannabinoidi sintetici (comecome HU-210). Tutti gli endocannabinoidi e cannabinoidi vegetali sono lipofile, cioè grassi solubili, composti.Attualmente ci sono due sottotipi conosciuti, chiamati recettori CB1 e CB2. Il recettore CB1 è principalmente espressa nel cervello(Sistema nervoso centrale o "CNS"), ma anche nei polmoni, fegato e reni. Il recettore CB2 è espresso principalmentenel sistema immunitario ed in cellule ematopoietiche Montaggio evidenza suggerisce che ci sono nuovi cannabinoidirecettori cioè non CB1 e CB2 non, che sono espressi in cellule endoteliali e nel SNC.Nel 2007, lalegame di vari cannabinoidi ad un recettore accoppiato a proteina G (GPCR) nel cervello è stata descritta.Le sequenze proteiche dei recettori CB1 e CB2 sono circa il 44% simile. Quando solo le regioni transmembrana dellarecettori sono considerati, ammino acido somiglianza tra i due sottotipi recettoriali è circa del 68%. InInoltre, piccole variazioni ciascun recettore sono stati identificati. I cannabinoidi si legano reversibilmente e stereo-selettivamente ai recettori dei cannabinoidi. L'affinità di un individuo per ciascun recettore cannabinoide determina l'effetto di tale cannabinoidi. Cannabinoidi che si legano selettivamente al più alcuni recettori sono più desiderabili per uso medico.



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 CB1Cannabinoidi recettore tipo 1 (CB1) sono ritenuti essere uno dei G più ampiamente espressi accoppiato a proteinarecettori nel cervello. Ciò è dovuto al endocannabinoidi mediata soppressione depolarizzazione indotta di inibizione, unforma molto comune di plasticità a breve termine, in cui la depolarizzazione di un singolo neurone induce una riduzioneNeurotrasmissione GABA-mediata. Gli endocannabinoidi rilasciati dal depolarizzato post-sinaptica dei neuroni si legano a recettori CB1recettori del neurone pre-sinaptico e causare una riduzione del rilascio di GABA.Si trovano anche in altre parti del corpo. Ad esempio, nel fegato, attivazione del recettore CB1 è notoper aumentare de novo lipogenesi. Attivazione dei recettori presinaptici CB1 è noto anche per inibire simpaticoinnervazione dei vasi sanguigni e contribuisce alla soppressione della risposta vasopressore neurogena in setticoshock.CONTATTI VIA; walsomlab@gmail.com


 Uno studio fatto su CB1 knockout mice (topi geneticamente modificati che non possono produrre CB1) ha mostrato un aumento dellatasso di mortalità. Hanno anche mostrato attività locomotoria soppressa così come ipoalgesia (diminuzione del doloresensibilità). I CB1 knockout mice hanno risposto alle Delta9-tetraidrocannabinolo THC.Ciò dimostra che o CB2 orecettori dei cannabinoidi sconosciuti hanno anche un significato farmacologico.CB2Articolo principale: cannabinoidi recettore di tipo 2Recettori CB2 sono espressi principalmente sulle cellule T del sistema immunitario, sui macrofagi e le cellule B, e incellule ematopoietiche. Essi hanno anche una funzione di cheratinociti, e sono espressi sul mouse preimpiantoembrioni. Essi sono espressi anche sulle terminazioni nervose periferiche. Questi recettori giocano un ruolo nella antinocicezione, oil sollievo del dolore. Nel cervello, essi sono espressi principalmente dalle cellule microgliali, dove il loro ruolo rimane poco chiaro.Mentre gli obiettivi cellulari più probabili ed esecutori dei CB2 effetti recettore-mediati di endocannabinoidi oagonisti sintetici sono le cellule immunitarie e immuno-derivato (ad esempio leucociti varie popolazioni di T e Blinfociti, monociti / macrofagi, cellule dendritiche, mastociti, microglia nel cervello, cellule di Kupffer nelfegato, ecc), il numero di altri potenziali obiettivi cellulari è in espansione, che ora comprende endoteliale e lisciacellule muscolari, fibroblasti di varia origine, cardiomiociti, e alcuni elementi neuronali della periferica osistema nervoso centrale.CONTATTI VIA; walsomlab@gmail.com

 EstrattoIl dolore alle articolazioni è un problema clinico comune per il quale entrambe le malattie articolari infiammatorie e degenerative sono importanticause. Lo scopo di questo studio era di studiare il ruolo di recettori CB1 e CB2 dei cannabinoidi nellaalterazioni comportamentali, istologico, e neurochimiche associate a dolori articolari. Il modello murino di monosodicoiodoacetato (MIA) è stato utilizzato per indurre il dolore nei topi knockout per i recettori CB1 (CB1KO) e CB2 dei cannabinoidi(CB2KO) e topi transgenici iperespressione di recettori CB2 (CB2xP). Inoltre, abbiamo valutato i cambiamenti indotti daMIA nell'espressione genica dei recettori CB1 e CB2 dei cannabinoidi e μ-, δ-e recettori κ-oppioidi nella zona lombare della colonna vertebralespinale di questi topi. Topi wild-type, così come CB1KO, CB2KO e topi CB2xP, sviluppati allodinia meccanica nelzampa ipsilaterale dopo l'iniezione intra-articolare MIA. CB1KO e CB2KO dimostrato simili livelli di meccanicaallodinia di quella osservata in topi wild-type nella zampa ipsilaterale, mentre allodinia era significativamente attenuatoin CB2xP. È interessante notare che, CB2KO visualizzata un'immagine speculare controlaterale del dolore sviluppare allodinia meccanica anchenella zampa controlaterale. Tutte le linee del mouse sviluppato alterazioni istologiche simili dopo MIA intra-articolareiniezione. Nondimeno, iniezione intra-articolare MIA prodotto variazioni specifiche nell'espressione di cannabinoidee geni dei recettori oppioidi nel midollo spinale lombare che sono stati ulteriormente modulato dalla alterazione genetica diil sistema dei recettori dei cannabinoidi. Questi risultati hanno rivelato che CB2 recettore gioca un ruolo predominante nel controllodi manifestazioni dolori articolari ed è coinvolto nei cambiamenti adattativi indotti nel sistema degli oppioidi in questo dolorestato.Caratterizzazione dei fattori intrinseci ed estrinseci regolano la self-renewal/division e differenziazione deicellule staminali è fondamentale nel determinare staminali embrionali (ES), il destino della cellula. Le cellule staminali si differenziano in piùlinee ematopoietiche corpo durante embrioide (EB) la formazione in vitro, che fornisce una piattaforma sperimentale perdefinire i meccanismi molecolari che controllano determinazione destino strato germe e formazione del tessuto.Metodi e risultatiIl tipo di recettore dei cannabinoidi 1 (CB1) e cannabinoidi recettore di tipo 2 (CB2) sono membri della accoppiati a proteine ​​Grecettore (GPCR), la famiglia, che vengono attivati ​​da ligandi endogeni, gli endocannabinoidi. Espressione del recettore CB1 èabbondante nel cervello, mentre i recettori CB2 sono principalmente espressi in cellule ematopoietiche. Tuttavia, l'espressione e laruoli precisi di CB1 e CB2 e loro ligandi congiunti in cellule ES non sono noti. Abbiamo osservato significativa induzionedei recettori CB1 e CB2 dei cannabinoidi durante il differenziamento ematopoietico di ES murine (MES) di derivazione embryoidcorpi. Inoltre, cellule MES così come corpi embrionali ES-derivati ​​a giorni 7 e 14, endocannabinoidi espresse,i ligandi sia CB1 e CB2. I recettori CB1 e CB2 antagonisti (AM251 e AM630, rispettivamente) indotta cellule MESmorte, suggerendo fortemente che gli endocannabinoidi sono coinvolti nella sopravvivenza delle cellule MES. Trattamento delle cellule MEScon il ligando cannabinoide esogeno Δ9-THC ha determinato l'aumento del differenziamento ematopoietico di cellule MES,mentre l'aggiunta di AM251 o AM630 bloccato formazione embryoid corpo derivato dalle cellule MES. Inoltre,agonisti dei cannabinoidi inducono la chemiotassi di ES-derivati ​​corpi embrionali, che è stato specificamente inibita dallaCB1 e CB2 antagonisti.ConclusioniQuesto lavoro non è stato affrontato in precedenza e produce nuove informazioni sulla funzione dei recettori dei cannabinoidi,CB1 e CB2, come componenti di una nuova via di regolazione murino differenziazione cellulare ES. Questo studio fornisceintuizioni coinvolgimento del sistema cannabinoide nella sopravvivenza delle cellule ES e differenziazione ematopoietiche.IntroduzioneStaminali (MES), le cellule embrionali murine, derivate dalla massa cellulare interna dell'embrione preimplanted, sono pluripotenti emantenere la capacità di differenziarsi in cellule di tutti tre strati germinali dello sviluppo dell'embrione di topo.La comprensione dei meccanismi di regolamentazione responsabili del differenziamento ematopoietico di cellule MES è crucialenel definire i percorsi e gli eventi molecolari che determinazione strato di germe di controllo e formazione del tessuto.Cellule ES mostrano anche la capacità di contribuire ad una vasta gamma di tipi di cellule ben definite quando si utilizzano diversi inmodelli in vitro di differenziamento. Nei saggi di differenziamento in vitro utilizzando colture ES comportano la rimozione di leucemiafattore inibitorio (LIF) e separazione delle cellule dal feeder layer in condizioni che promuovono laformazione di aggregati di cellule staminali embrionali, definito corpi embrionali (EBS).Questi EBs contiene una serie di diversitipi cellulari. Saggi molecolari in combinazione con in vitro la differenziazione saggi di cellule staminali fornisconointuizioni gli eventi molecolari precoci associati a specifiche lignaggio.Sebbene la differenziazione in vitro di cellule ematopoietiche staminali è stata caratterizzata sia a cellulare elivello molecolare, le vie che regolano il differenziamento ematopoietico di cellule staminali embrionali non sono ben definiti. Le cellule staminali possono essere espanse ex vivo da cellule indifferenziate che conservano un cariotipo normale o,in alternativa, possono essere differenziati ex vivo in tipi cellulari di tutti i tre strati germinali [2]. LIF è tenuto amantenere lo stato indifferenziato delle cellule ES, mentre il ritiro della LIF avvia la formazione di EB edifferenziazione cellulare [3], [4]. Anche se EBs sono molto meno organizzati di quelli dell'embrione vero e proprio, che possonomimare in parte l'organizzazione spaziale nell'embrione. I meccanismi di sviluppo del vascolare ed ematopoieticosistemi EBs sono simili a quelle del sacco vitellino.Recettore (GPCR) membri della proteina G-accoppiati hanno un ruolo centrale nella regolazione della distribuzione spaziale delle immaturoe cellule ematopoietiche mature, compresa la loro immissione in circolazione e homing di tessuto emopoietico.GPCR sono stati collegati a molte funzioni, tra cui la proliferazione cellulare, la maturazione, la sopravvivenza, l'apoptosi, emigrazione [9] - [12]. I recettori dei cannabinoidi CB1 e CB2 sono membri della famiglia GPCR. I recettori CB2 sonoespresso principalmente in mieloidi, macrofagi, eritroide, linfoide e mastociti [13]. Il recettore dei cannabinoidi del cervelloCB1 è anche espresso in cellule ematopoietiche come i linfociti, splenociti e cellule T, ma soprattutto recettori CB1sono espressi ad alti livelli nel sistema nervoso centrale (SNC) dove regolano l'attenuazione della sinapticatrasmissione e psicoattività [14] - [20]. Ad oggi, più lipidi endogeni che sono derivati ​​di catena lungaGli acidi grassi sono stati isolati e caratterizzati come ligandi naturali, e sono chiamati endocannabinoidi.Endocannabinoidi sono sintetizzati in vivo da vari tessuti su richiesta tramite scissione di precursori di membrana, esono coinvolti in processi di segnalazione a corto raggio [21]. Quattro tipi di composti endogeni sono stati scoperti cosìlontano e stato proposto di agire come endocannabinoidi: 1) l'anandamide (AEA) (N-arachidonoil-etanolammina) e alcuni dei suoiDerivati, 2) 2-arachidonoilglicerolo (2-AG) ed etere noladin (2-arachidonoil glicerolo etere), 3) virodhamine(O-arachidonoil-etanolammina) e 4) N-arachidonoil-dopamina (NADA). Fin dalla loro scoperta, endocannabinoidi,anandamide e 2-AG in particolare, sono stati implicati in funzioni fisiologiche così come in molti patologicacondizioni. Endocannabinoidi sono stati isolati dal cervello e dalla milza e altre periferichetessuti [21]. La presenza degli endocannabinoidi in cellule ematopoietiche ed immuni suggerisce che CB2 e la sualigandi endogeni possono svolgere ruoli fisiologici importanti nella regolazione delle reazioni infiammatorie e immunitarierisposte [22]. Tuttavia, l'espressione, funzione ed i ruoli precisi di CB1 e CB2, nonché la loro cognateligandi, in cellule ES sono sconosciuti.Cannabinoidi naturali sono i costituenti di piante di marijuana [23]. Δ9-tetraidrocannabinolo (THC =), uno dei principalicostituente psicoattivo della marijuana, interagisce sia con il CB1 e CB2, suscitando così una varietàdi risposte farmacologiche in vitro e in vivo [24]. Molti agonisti sono stati sviluppati che sono selettivi peril CB1 (ACPA, ACEA) e recettori CB2 (JWH-015, JWH-133) e hanno affinità significativamente più elevati per un recettorerispetto all'altro [24] - [29]. Inoltre, vari antagonisti che inibiscono specificamente i recettori CB1 o CB2 hannoinoltre stati sviluppati. Anandamide e 2-AG sono ligandi endogeni, i membri della classe di eicosanoidi dei cannabinoidi,che sono derivati ​​dell'acido arachidonico e sono strutturalmente diversa dalle altre classi cannabinoidi.Ipotizziamo che CB1 e CB2 svolgono ruoli regolatori nel differenziamento ematopoietico di cellule ES e cheendocannabinoidi sono importanti per la sopravvivenza delle cellule ES. Qui, abbiamo esaminato l'espressione e la funzione dei recettori CB1e CB2 in cellule MES e determinato il loro ruolo nella differenziazione delle cellule ematopoietiche MES. Abbiamo anche analizzato ilespressione di endocannabinoidi in cellule MES e determina gli effetti di antagonisti dei cannabinoidi su cellule ESCONTATTI VIA; walsomlab@gmail.com

 
sopravvivenza.RisultatiL'espressione di CB1 e CB2 in cellule staminali embrionali murine e corpi embrionali murinePer esaminare l'espressione di CB1 e CB2 in cellule MES, abbiamo effettuato analisi RT-PCR su controllo ES indifferenziatecellule (Rosa26.6 e E14 cellule ES) e su EBs derivati ​​dalla differenziazione ematopoietiche secondario di questi dueLinee di cellule ES in momenti diversi, come indicato. Abbiamo trovato che i recettori CB1 e CB2 mRNA e proteine ​​sono state indottesostanzialmente in ematopoietica EBs differenziato rispetto alle cellule di controllo ES.Come mostrato nella Figura 1A e B, unasignificativa induzione di CB1 e CB2 espressione genica è stata osservata nel giorno 8 e il giorno 11 ematopoietiche EBs sia daRosa26.6 e E14 cellule ES, mentre cellule MES indifferenziate avevano poca espressione di CB1 e CB2. Interessante,espressione di CXCR4 (un membro della famiglia GPCR) è stata osservata in cellule ES indifferenziate e non è stata modificatadurante il differenziamento delle cellule ES (Fig. 1A). Abbiamo anche analizzato diversi marcatori ematopoietici in questi ematopoieticheEBS. Abbiamo osservato induzione di Sca-1 espressione, così come induzione di PECAM-1 e FLK-1 espressione durante cellule ESdifferenziazione (Fig. 1 C), che è in accordo con altri studi pubblicati [30].Prossimo, CB1 e CB2 espressione della proteina è stata analizzata in Rosa26.6 e E14 cellule ES da analisi Western blot utilizzando duediversi set di anticorpi specifici CB1 e CB2, commercialmente disponibili da Chemicon (set 1) (Fig. 2) e Sigma(Set di 2) (dati non riportati). Entrambe le serie di anticorpi specifici CB1 e CB2 hanno mostrato induzione di CB1 e CB2 proteineespressione durante il differenziamento delle cellule ES in giorno 8 e 11 EBs derivato dalla differenziazione secondaria, comedimostrato da analisi Western blot (Fig. 2) e immunoistochimica (dati non mostrati).Questi risultati hanno mostrato cheCB1 e CB2 sono entrambi sovraregolati durante il differenziamento ematopoietico di cellule ES e implica che CB1 e CB2possono avere una significativa funzione di differenziazione delle cellule ES.Espressione degli endocannabinoidi nel cellule MES e corpi embrionali derivate da cellule MES nei giorni 7 e 14Per verificare se cellule MES così come EBS derivati ​​da MES cellule esprimono endocannabinoidi, cellule MES eranoanalizzati per l'espressione di diversi acidi grassi e loro derivati ​​etanolamide e monogliceridi mediante LC-APCI-MS analisi [31]. Come mostrato in figura 3, le derivazioni di endocannabinoidi sono stati rilevati e quantificati nellacellule MES ed EBS a giorni 7 e 14. Il livello di anandamide (AEA) espressione nelle cellule MES era molto inferiore comerispetto a quella del 2-AG e AEA non è stato rilevato a tutti in EBs a 7 e 14 giorni. I livelli di espressione di: 2-AG,acido docosaesaenoico (DHA), acido arachidonico (AA), glicerolo 2-oleoil (2-OG), acido eicosapentaenoico (EPA), 2 -docosahexaenoyl glicerolo (2-DHG) e glicerolo 2-eicosapentaenoyl (2-EPG), erano abbondanti nelle cellule MES, ed EBS agiorni 7 e 14. Livelli di endocannabinoidi nelle cellule staminali embrionali sono stati correlati al numero di cellule MES (datinon mostrato). Queste analisi hanno mostrato che cellule MES abbondantemente esprimono endocannabinoidi, precisamente il 2-AG, che potrebbeessere importante per la loro sopravvivenza. Inoltre, dal momento che entrambi EBs nei giorni 7 e 14 express endocannabinoidi, questo potrebbesuggeriscono che gli endocannabinoidi possono giocare un ruolo nel differenziamento ematopoietico di cellule MES.Effetti della esogeni ed endogeni ligandi cannabinoidi sulla chemiotassi di cellule MESUna delle principali funzioni del 2-AG endocannabinoide è la stimolazione della migrazione in linfociti B [32]. Poiché CXCR4 eil suo legante affine SDF-1α sono coinvolti nella chemiotassi di cellule staminali ematopoietiche, le migrazioni e homing [33] - [45], edal CXCR4, CB1 e CB2 sono membri della famiglia GPCR, abbiamo quindi studiato se ligandi cannabinoidi agiscono comeagenti chemiotattici o chemokinetic di cellule ES. Abbiamo analizzato gli effetti del cannabinoide endogeno legante 2-AG,il ligando esogeno Δ9-THC e lo specifico agonista del recettore CB2, JWH-015, sulla chemiotassi di indifferenziatoCellule ES, nonché il giorno 10 EBS derivato dal secondario differenziamento ematopoietico.I saggi di chemiotassi sono state eseguite utilizzando costar Transwells (Corning-Costar, Cambridge, MA). Come mostrato in figura 4,chemiotassi è stata osservata con differenziata EBs al giorno 10 in presenza del Δ9-THC, 2-AG e JWH-015ligandi cannabinoidi, mentre la chemiotassi delle cellule ES indifferenziate era molto basso. Questo chemiotassi è stata inibitadai CB1 e CB2 inibitori specifici, AM251 e AM630, rispettivamente. Così, ligandi cannabinoidi, come 2-AG,esogena Δ9-THC e JWH-015 inducono la chemiotassi delle cellule EB ES-derivati ​​differenziati ematopoietiche, mediataattraverso entrambi i recettori CB1 e CB2.Effetti degli inibitori cannabinoidi sulla sopravvivenza della Rosa cellule ESPer analizzare gli effetti del Δ9-THC sulla sopravvivenza della Rosa cellule staminali, le cellule ES Rosa sono stati trattati o trattati conΔ9-THC (1 mM) o con gli inibitori specifici per CB1 (AM251) o CB2 (AM630) (in assenza di Δ9-THC) per 48ore. Inoltre, Rosa cellule ES sono state trattate con DMSO (0,01%) o con metanolo (0,01%) da comandi al veicolo.Dopo 48 ore, le cellule sono state analizzate per la vitalità. Come si vede in figura 5, effetti sulla vitalità cellulare Rosa ES eranoosservata dopo il trattamento con DMSO o metanolo rispetto alle cellule ES cannabinoide-trattati. Δ9-THC inoltre non ha avutoeffetti apoptotici sulle cellule ES Rosa. Tuttavia, entrambi gli inibitori (AM251 e AM630) morte cellulare indotta significativoin assenza di Δ9-THC (Fig. 5). Questi risultati suggeriscono che gli endocannabinoidi, o secrete da cellule ES e / odai fibroblasti (PEF) cellule di alimentazione embrionali primarie, sono importanti per la sopravvivenza delle cellule ES e cheinibizione specifica di questi ligandi endogeni da inibitori per CB1 e CB2 risultati in apoptosi delle cellule.Effetti di endocannabinoidi e ligandi cannabinoidi esogeni sulla differenziazione delle cellule MESPer esaminare gli effetti dei cannabinoidi esogeni ligandi sulla differenziazione delle cellule ES, il ligando Δ9-THC (1 mM) è statoaggiunto alla Rosa cellule ES in DMEM. L'inibitore specifico CB1 AM251 (1 mM) e l'inibitore specifico CB2 AM630(1 mM) sono stati utilizzati per bloccare gli effetti dei ligandi cannabinoidi sulla differenziazione delle cellule ES, come indicato. Gliaggiunta di AM251 o AM630 o aggiunta del controllo del veicolo DMSO (0,01%) e metanolo (0,01%) è stata eseguita durantela fase di differenziazione primaria e secondaria differenziazione ematopoietiche di Rosa cellule ES in EBS. Cellule ESstate preincubate con AM251 o AM630 o con comando DMSO veicolo o metanolo per 30 min. Le cellule sono state poilavato e ulteriormente coltivate in vitro per la differenziazione ematopoietica oltre 14 giorni in presenza o assenzadel Δ9-THC, come descritto sopra. Il numero di EBs stato contato dopo 14 giorni.Come mostrato in figura 6, Δ9-THC ha indotto unaumento del numero di EBs rispetto alle cellule ES controllo. Tuttavia, quando Δ9-THC è stato somministrato inpresenza di AM251 o AM630, c'è stata una diminuzione del numero di EB (fino al 70-75% di inibizione). Interessante,AM251 AM630 alone o inibito anche il numero di EBs derivati ​​da cellule ES (Fig. 6).Questo risultato suggerisce chequesti inibitori bloccano gli effetti sulle cellule ES-derivati ​​EBs che sono mediati dal endocannabinoide endogenoligandi, secrete da entrambe le cellule ES o cellule alimentatore PEF e che l'inibizione di CB1 e / o CB2 receptor-effetti mediati, con specifici inibitori CB1 e CB2, significativamente blocchi formazione EB.DiscussioneUn recente lavoro ha collegato i cambiamenti nella funzione immunitaria a biologico e il targeting terapeutico dei recettori dei cannabinoidi[13]. Espressione del recettore dei cannabinoidi offre un nuovo principio per l'omeostasi immunitaria regionale e malattiasuscettibilità, e si estende e perfeziona il razionale per l'immunoterapia CB2-mirata in immunitaria e infiammatoriamalattie. Pertanto, delucidazione degli effetti del sistema cannabinoide (specialmente CB2-trasdotte segnalazione) oncellule staminali di auto-rinnovamento, la proliferazione e la differenziazione dovrebbe portare alla creazione di nuovi terapeuticoapprocci per disturbi ematologici, nonché nuove strategie che coinvolgono il supporto farmacologico percellule staminali ematopoietiche (HSC) terapie basate.Qui, abbiamo caratterizzato l'espressione e la funzione dei recettori CB1 e CB2 dei cannabinoidi in cellule ES murine ein ES-derivati ​​EBS, e ha esaminato il ruolo degli endocannabinoidi ei loro recettori cognate, CB1 e CB2, come romanzocomponenti di un nuovo percorso importante nella differenziazione delle cellule ES murine. Per verificare l'ipotesi che il CB1 eRecettori CB2 potrebbero avere ruoli complementari nella differenziazione ematopoietico di cellule ES, abbiamo impiegato ES-derivatimetodi di differenziazione utilizzando il saggio embryoid Corpo, che è ben controllata, facilmente manipolabile efisiologicamente rappresentativa del sistema in vivo. Abbiamo dimostrato significativo up-regolazione dei recettori CB1 e CB2 mRNAe proteine ​​in ematopoietiche EBs nei giorni 8 e 11 in entrambe le Rosa26.6 cellule ES e E14 cellule. L'agonista cannabinoideΔ9-THC e gli endocannabinoidi indotto la chemiotassi di EB derivato da entrambi Rosa26.6 o E14 cellule a giorno 10.Il trattamento di cellule MES con il cannabinoide CB1 AM251 antagonista o con cannabinoidi CB2 antagonista AM630 ha provocatonella morte di queste cellule, indicando il coinvolgimento degli endocannabinoidi nella sopravvivenza cellulare MES. Cellule ES murinesono stati trovati ad esprimere abbondantemente endocannabinoidi tra cui il endocannabinoide 2-AG, che possono svolgere un ruolo nel MESsopravvivenza cellulare. Inoltre, EBS nei giorni 7 e 14 anche endocannabinoidi esplicite, suggerendo che gli endocannabinoidimediare il differenziamento ematopoietico di cellule MES, dato che i numeri di EBs derivate dalle cellule MES erainibito in presenza di AM251 e AM630. Questi risultati mostrano che sia CB1 e CB2, nonché la loroagonisti cognate, sono importanti regolatori della sopravvivenza delle cellule MES e differenziazione.La disponibilità di cellule staminali fornisce nuovi approcci per il trattamento di malattie umane. Delucidazione delmeccanismi di regolamentazione responsabili della differenziazione delle cellule staminali è fondamentale per l'applicazione di cellule staminali per la salute umanamalattie [46]. Cellule ES di topo subiscono illimitato di auto-rinnovamento, alla presenza del LIF citochina, pur conservandola loro capacità di differenziazione multi-lignaggio. Ritiro di LIF e l'aggregazione delle cellule porta alladifferenziazione delle strutture conosciute come corpi embrionali (EBS). Durante la differenziazione, alcuni geni vengono sovraregolatie molti altri sono inibiti in modo intricato controllato.Ad ogni divisione cellulare ES, l'esito alternativa di subire auto-rinnovamento o la differenziazione è deciso dalinterazione tra fattori intrinseci e segnali estrinseci o selettiva. Tuttavia, ad oggi la biologia intrinseca diqueste cellule ES rimane poco definiti. La stimolazione di cellule ES auto-rinnovamento è stato trovato per essere limitato a LIFe citochine correlate della famiglia IL-6, il quale segnale attraverso il recettore gp130 via JAK chinasi mediata da STAT3attivazione [46] - [48]. Segnalazione PI3-chinasi è stata osservata anche a svolgere un ruolo importante nella sopravvivenza cellulare MES eprogressione del ciclo cellulare [49]. Recentemente, STAT3 è stato segnalato per essere la chiave fattore di trascrizione a valle delCONTATTI VIA;
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 LIF/gp130 percorso di segnalazione nelle cellule MES. Inoltre, il Ca2 + percorso di segnalazione nelle cellule MES è stato anche dimostrato dimediare la funzione delle cellule Mes [50]. Sulla base dei nostri risultati, suggeriamo che il sistema dei cannabinoidi è un ulteriorepathway coinvolti nella sopravvivenza delle cellule MES e differenziazione.La maggior parte dei protocolli di differenziazione diretti utilizzano un primo passo di aggregazione EB. Pertanto, l'early-agendo differenziazione-promuovono attività che si verificano all'interno del EBs sono in gran parte sconosciuti. Sulla base dei nostri risultati, abbiamosuggeriscono che i cannabinoidi esogeni possono indurre o promuovere il differenziamento ematopoietico. cellule MES esprimono entrambi CB1e CB2 ed entrambi i recettori sono funzionali. L'aggiunta di agonisti dei cannabinoidi esogeni selettivi aumentatala formazione del corpo embrioide derivato da cellule MES, indicando che ligandi cannabinoidi indotto il ematopoieticodifferenziazione delle cellule MES attraverso CB1 e CB2 in entrambe le cellule MES e le cellule MES EB-derivati. Interessante, CB2recettori sono stati recentemente trovati per promuovere il mouse proliferazione delle cellule staminali neurali (NSCP) [47]. Agonisti dei cannabinoidianche aumentato in vitro NSCP proliferazione e la generazione di neurosfere [47]. Il contributo degli endocannabinoidi aneurogenesi all'interno della zona subventricular stato riconosciuto per la ridotta proliferazione dei precursori neurali inRecettore CB1 knockout mice [47]. Così, queste osservazioni insieme con i nostri risultati suggeriscono fortemente che sia CB1attivazione e CB2 sono coinvolti nel mantenimento delle cellule MES e che il sistema endocannabinoide è essenzialela sopravvivenza delle cellule staminali e di cellule staminali ematopoietiche differenziazione.Materiali e MetodiComposti Anticorpi e chimici e biologiciGli anticorpi anti-CB1 e CB2 (anti-ABR-Affinity BioReagents, Golden, CO) sono stati utilizzati per immunoistochimica. Gliimmunofenotipizzazione di CB2 è stata confermata con l'uso di un altro anticorpo anti-CB2 ottenuta da Sigma (St. Louis,MO). I ligandi cannabinoidi Δ9-THC (THC), JWH133, methanandamide e CP55940 sono stati ottenuti anche da Sigma. ACEAe gli antagonisti del recettore dei cannabinoidi AM251 e AM630 sono stati acquistati da Tocris (Ellisville, MO). G-CSF(Neupogen) è stato ottenuto da Amgen Inc. (Thousand Oaks, CA). MethoCult 03434 (per cellule di topo) è stato ottenuto daStemCell Technologies (Vancouver, BC, Canada). Gli endocannabinoidi deuterato utilizzati come standard interni nelAnalisi LC-APCI-MS sono stati sintetizzati in-house presso il Center for Drug Discovery, Northeastern University (Boston,MA) in seguito ha riferito metodi [31].Analisi RT-PCR di CB1 e CB2 espressioneRNA da cellule totali MES è stato estratto utilizzando il kit RNeasy Mini (Qiagen, Valencia, CA) seguendo laprotocollo del produttore. Una colonna di spin QIAshredder e DNasi digestione sono stati inclusi nella procedura di isolamento alimitare la possibilità di amplificazione PCR CB1 e CB2 dal DNA genomico.l'amplificazione del cDNA e PCR eranoeseguita con il BD Biosciences TITANIO One-Step RT-PCR Kit usando 200 ng di RNA come stampo per primo filamentosintesi. CB1 è stato amplificato utilizzando primer: 5'-CGT GGG CAG CCT CCT GTT CA-3 'e 5'-CAT GCG GGC TTG GTC TGG-3', cheottenere un prodotto di 403 bp. CB2 è stato amplificato utilizzando: 5'-CCG GAA AAG AGG ATG ATG GCA AAT-3 'e 5-CTG CTG AGC GCC CTGGAG AAC-3 ', che producono un prodotto di 479 bp. GAPDH è stato utilizzato come controllo positivo con primer: 5'-CTC ACT GGC ATGGCC TTC CG-3 'e 5'-ACC ACC CTG TTG CTG TAG CC-3', che producono un prodotto di 292 bp. Il modello è stato il primo denaturatoa 94 ° C per 2 min seguita da 35 cicli (94 ° C per 30 sec, 58 ° C per 30 sec e 68 ° C per 1 min), seguito da 68 ° C per2 min in un myCycler Personal Thermal Cycler (Bio-Rad Laboratories, Inc). Aliquote (20 ml) dei prodotti di PCR sono statieseguito su un gel di agarosio 1,2% contenente 0,5 mg / ml di bromuro di etidio.Origination di corpi embrionali da cellule ESLa linea cellulare Rosa26.6 ES è stato ottenuto da Dr. Stuart Orkin (Ospedale dei Bambini, Harvard Medical School); L'E14e-GFP E14 linee cellulari sono stati ottenuti dal Dott. Bing Lim (Beth Israel Deaconess Medical Center, Boston). Cultura emantenimento delle cellule ES in uno stato indifferenziato sono stati eseguiti come precedentemente descritto [1]. In breve, le cellule ESsono stati mantenuti su una linea cellulare PEF alimentatore topo in ES mezzo contenente mezzo di Eagle modificato da Dulbecco (DMEM)con elevato glucosio, 10 ng / ml di fattore inibitorio di leucemia murina (dell'MLIF; Internazionale Chemicon, Temecula, CA), 15%siero fetale di vitello (FCS; Hyclone, Logan, UT), 1 mM sodio piruvato, glutammina 2 mM, 0,1 mM aminoacidi non essenziali,100 mM monotioglicerolo (MTG, Sigma), 50 U / ml di penicillina e 10 mg / ml di streptomicina. Le linee di cellule ES furonoanalizzate regolarmente, utilizzando una cella kit caratterizzazione ES (Chemicon), per la determinazione della fosfatasi alcalinaattività e la rilevazione dei marcatori di superficie e fattori di trascrizione che sono espresse da ES indifferenziatacellule, come Oct-4, Rex-1, SSE-1 e Genesis (Fox D-3).In vitro è stata eseguita differenziamento ematopoietico di cellule ES come descritto, essenzialmente secondo l'protocollo di StemCell Technologies. Il metodo corpo embryoid (EB) comporta due fasi: in primo luogo, cellule sfericheaggregati (chiamati corpi embrionali = EBS) sono generati che contengono ectodermica, mesodermica e endodermicoderivati ​​(= differenziazione primaria), in secondo luogo, tali aggregati vengono selezionati per i precursori emopoietici eampliato con fattori di crescita come IL-3 e IL-6 (= Secondario Differenziazione ematopoietiche). Brevemente, EBS eranogenerato in 1% culture metilcellulosa (1 × 104 cellule ES per 35 mm piastra di Petri).Per promuovere la differenziazione primariain EBS, le cellule ES sono state coltivate in terreno di differenziamento ES contenente il mezzo di Iscove di Dulbecco modificato(IMDM), 15% FCS (StemCell Technologies), 2 mM glutammina, 150 micron MTG, e 40 ng / ml di fattore delle cellule staminali murine (MSCF).Dopo 8 giorni di differenziamento, EBS sono stati raccolti e lavati. 1 × 104 di singole cellule sono state seminate a 1%metilcellulosa dal secondario terreno di differenziamento ematopoietico. 15% FBS, 2 mM L-glutammato, 150 pM MTG, 20%BIT (10% BSA, 10 pg / ml di insulina, 200 ug / ml di transferrina), 150 ng / ml MSCF, 30 ug / ml di IL-3, 30 ug / ml di IL-6 e 3 U / ml Eposono stati aggiunti al cultura per promuovere la differenziazione ematopoietica. Cellule sono state preparate per Wright-Giemsacolorazione, RT-PCR e occidentali blot in diversi momenti della cultura EB differenziazione, come indicato.Per determinare le caratteristiche dei vari tipi di progenitori emopoietici presenti durante cellule ESdifferenziazione, EBs da linee di cellule ES sono state raccolte dalle colture a 8 e 11 giorni (dal giornoreplating) per ottenere i progenitori ematopoietici. Cytospin preparazione di queste cellule è stato colorato con Wright-Giemsa ed esaminato al microscopio ottico. Cellule ES indifferenziate hanno un grande nucleo, minimal citoplasma,e uno o più nucleoli prominenti scuro. Progenitori emopoietici a EB-giorno 14 colture sono state identificate dala morfologia del erythroids, megacariociti, monociti / macrofagi, granulociti e mastociti, come analizzata al microscopio campo.CONTATTI VIA; walsomlab@gmail.com

 


 Saggi di chemiotassiI saggi di chemiotassi sono state eseguite utilizzando il formato 5 micron-pori e 6,5 mm di diametro costar Transwells (Corning-Costar,Cambridge, MA), come precedentemente descritto [30]. Le cellule sono state lavate due volte con soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS)media, risospese in 100 ml di medie [Medium di Iscove Modified Dulbecco (IMDM) più 0,5% di BSA] e collocato nelcamera superiore delle Transwells. Nella camera inferiore, 600 microlitri di terreno, con o senza ligando è stato posto, comeindicato. Dopo 4 ore di incubazione a 37 ° C e 5% di CO2, la camera superiore è stato rimosso e il numero di migraticellule è stato determinato utilizzando un contatore di cellule CASY / TTC. Il ligando Δ9-THC (Δ9-tetraidrocannabinolo) e il endogenolegante 2-AG (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI, Catalog # 62165) sono stati aggiunti a 1 micron di concentrazione dei media IMDM. Glispecifico agonista del recettore CB2 JWH-015 (Tocris numero di catalogo # 1341) è stato anche testato a una concentrazione 1 mM. GliCB1 AM251 inibitore specifico (1 mM) (Tocris numero di catalogo # 1117) e l'inibitore specifico CB2 AM630 (1 micron)(Tocris numero di catalogo # 1120) sono stati utilizzati per bloccare gli effetti dei ligandi cannabinoidi sulla chemiotassi di cellule ES. Per l'studi di inibizione, le cellule sono state pre-incubate con gli agonisti della serotonina per 30 min come indicato. SDF-1 alfa (25ng / ml) è stato utilizzato come controllo positivo (Peprotech Inc., numero di catalogo # 250-20A).Saggi di sopravvivenza2 × 104 Rosa cellule ES (per pozzetto di 96 pozzi), CB1 e CB2 ligandi specifici così come inibitori sono stati aggiunti alcoltura cellulare come indicato. A 1 microM concentrazione finale è stato utilizzato per CP55940 (CB1 e CB2 agonisti), ACEA (CB1ligando) e JWH133 (CB2 ligando). Una concentrazione finale di 1 mM di entrambi AM251 (CB1 inibitore) e AM630 (CB2 inibitore)è stato utilizzato, come indicato. Le cellule sono state incubate per due giorni in una atmosfera umidificata CO2. Il saggio MTT eraeseguite in conformità al manuale di Promega (Promega Cat # G5421), e l'assorbanza a 490 nm è stato poi registrato.Livelli di endocannabinoidi in cellule staminali embrionaliLa procedura di estrazione per gli standard di calibrazione è stata eseguita come descritto [31]. Cells (cellule MES, EBS agiorno 7 e EBs al giorno 14), a varie concentrazioni, come indicato, sono stati omogeneizzati in acetone freddo: PBS, pH 7.4(31). Gli omogenati sono stati sonicato per 30 secondi prima centrifugazione a 20.800 g per 5 minuti. L'acetonedai sovranatanti risultanti stato rimosso sotto azoto. Al supernatante residuo, 50 microlitri di PBS, un volume dimetanolo e due volumi di cloroformio sono stati aggiunti per estrazione in fase liquido-liquido dei lipidi. Le due fasierano separate per centrifugazione e lo strato organico inferiore è stata evaporata sotto azoto. I campioni cellulari sono statiricostituito in 50 ml di etanolo.Il sistema utilizzato per l'analisi è stato un TSQ Quantum Ultra triplo quadrupolo spettrometro di massa (Thermo Electron, SanJose, CA) con un Agilent 1100 HPLC sull'estremità anteriore (Agilent Technologies, Wilmington, DE). La fase mobile

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 consisteva di 10 mM acetato di ammonio (pH 7,3 utilizzando idrossido di ammonio; A) e 100% di metanolo (B). Separazione di ciascunanalita è stato ottenuto utilizzando un Zorbax SB-NC 2.1 × 50mm, 5 micron, 80A, colonna (Agilent Technologies) e gradiente di eluizione;l'autocampionatore è stato mantenuto a 4 ° C per prevenire la degradazione dell'analita. Picchi eluiti sono stati ionizzati attraverso atmosfericoionizzazione chimica a pressione (APCI) e rilevato dalla transizione SRM di ciascun analita.L'analisi statisticaI risultati sono rappresentati come media ± Š.D. Il significato dei dati è stata determinata da un test t a due code.P <0.05 è stato considerato statisticamente significativo.Fonte, grafici e cifre: espressione e la funzione dei recettori dei cannabinoidi CB1 e CB2 e loro affiniLigandi cannabinoidi in cellule staminali embrionali murini