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Los receptores de cannabinoides son una clase de receptores de membrana celular bajo la superfamilia de receptores de proteína G-junto.Como es típico de los receptores acoplados a la proteína G, los receptores de cannabinoides contienen siete transmembrana que abarcadominios. Los receptores cannabinoides son activados por tres grandes grupos de ligandos, endocannabinoides (producido por lacuerpo de mamíferos), los cannabinoides de la planta (como THC, producido por la planta de cannabis) y cannabinoides sintéticos (talescomo HU-210). Todos los endocannabinoides y cannabinoides de la planta son lipofílicas es decir, grasa, compuestos solubles.Actualmente existen dos subtipos conocidos, denominados CB1 y CB2. El receptor CB1 se expresa principalmente en el cerebro(Sistema nervioso central o "SNC"), sino también en los pulmones, el hígado y los riñones. El receptor CB2 se expresa principalmenteen el sistema inmune y en las células hematopoyéticas La evidencia creciente sugiere que hay novela cannabinoidereceptores, es decir, no CB1 y no CB2, que se expresan en las células endoteliales y en el SNC. En 2007, elunión de varios cannabinoides a un receptor acoplado a proteína G (GPCR) en el cerebro fue descrito.Las secuencias de proteínas de receptores CB1 y CB2 son aproximadamente 44% similares. Cuando sólo las regiones transmembrana de lareceptores se consideran, aminoácidos similitud entre los dos subtipos de receptores es de aproximadamente 68%. EnAdemás, se han identificado variaciones menores en cada receptor. Los cannabinoides se unen reversiblemente y estéreo-selectivamente a los receptores de cannabinoides. La afinidad de un cannabinoide individual a cada receptor determina elefecto de que los cannabinoides. Los cannabinoides que se unen más selectivamente a ciertos receptores son más deseables para uso médico.
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CB1Receptor cannabinoide tipo 1 (CB1) se cree que son uno de los más ampliamente expresado T acoplado a la proteínareceptores en el cerebro. Esto es debido a la supresión inducida por despolarización endocannabinoide mediada por la inhibición de, unaforma muy común de la plasticidad a corto plazo en el que la despolarización de una sola neurona induce una reducción enLa neurotransmisión mediada por GABA. Los endocannabinoides liberados de la despolariza bind neurona post-sináptica a CB1receptores en la neurona presináptica y causan una reducción en la liberación de GABA.También se encuentran en otras partes del cuerpo. Por ejemplo, en el hígado, se conoce la activación del receptor CB1para aumentar la lipogénesis de novo. La activación de los receptores presinápticos CB1 también es conocida para inhibir simpáticoinervación de los vasos sanguíneos y contribuye a la supresión de la respuesta vasopresora neurogénica en sépticoshock.CONTACT; walsomlab@gmail.com
Un estudio realizado en ratones knockout CB1 (ratones genéticamente alterados que no pueden producir CB1) mostró un aumento entasa de mortalidad. Ellos también muestran actividad locomotora suprimido, así como hipoalgesia (disminución del dolorsensibilidad). Los ratones knockout CB1 han respondido a Delta9-Tetrahidrocannabinol THC. Esto demuestra que, o bien o CB2receptores de cannabinoides desconocidos también tienen importancia farmacológica.CB2Artículo principal: receptor cannabinoide tipo 2Receptores CB2 se expresan principalmente en las células T del sistema inmune, en los macrófagos y células B, y encélulas hematopoyéticas. Ellos también tienen una función en los queratinocitos, y se expresan en el ratón pre-implantaciónembriones. También se expresan en los terminales nerviosos periféricos. Estos receptores juegan un papel en la antinocicepción, oel alivio del dolor. En el cerebro, que se expresan principalmente por células de la microglía, donde su papel sigue siendo poco claro.Mientras que las dianas celulares más probables y ejecutores de los efectos mediados por receptores CB2 de los endocannabinoides oagonistas sintéticos son las células inmunes e inmunes derivados (por ejemplo, los leucocitos, varias poblaciones de T y Blinfocitos, monocitos / macrófagos, células dendríticas, mastocitos, microglia en el cerebro, las células de Kupffer en elhígado, etc), el número de otras dianas celulares potenciales se está expandiendo, ahora incluyendo endotelial y lisocélulas musculares, fibroblastos de diversos orígenes, cardiomiocitos, y ciertos elementos neuronales de la periférica osistemas nervioso central.
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AbstractoDolor en las articulaciones es un problema clínico común para que ambas enfermedades articulares inflamatorias y degenerativas son las principalescausas. El propósito de este estudio fue investigar el papel de los receptores CB1 y CB2 de cannabinoides en laalteraciones de comportamiento, histológicos y neuroquímicos asociados con dolor en las articulaciones. El modelo murino de monosódicoyodoacetato (MIA) se utilizó para inducir el dolor en las articulaciones en los ratones knockout para CB1 (CB1KO) y los receptores CB2 de cannabinoides(CB2KO) y ratones transgénicos que sobreexpresan los receptores CB2 (CB2xP).Además, se evaluaron los cambios inducidos porMIA en la expresión génica de los receptores CB1 y CB2 y-μ, δ-cannabinoides y los receptores κ-opioides en la médula lumbarespinal de estos ratones. Los ratones de tipo salvaje, así como CB1KO, CB2KO, y los ratones CB2xP, desarrollaron alodinia mecánica en lapata ipsilateral después de MIA inyección intra-articular. CB1KO y CB2KO demostraron niveles similares de mecánicaalodinia de la observada en los ratones de tipo salvaje en la pata ipsilateral, mientras que la alodinia fue significativamente atenuadaen CB2xP. Curiosamente, CB2KO un reflejo contralateral del dolor desarrollando alodinia mecánica también se muestraen la pata contralateral. Todas las líneas de ratones desarrollaron cambios histológicos similares después de MIA intra-articularinyección. Sin embargo, el MIA inyección intra-articular produjo cambios específicos en la expresión de cannabinoidey genes de los receptores opioides en secciones de la médula espinal lumbar que eran más modulada por la alteración genética deel sistema receptor de cannabinoides. Estos resultados revelaron que el receptor CB2 juega un papel predominante en el controlmanifestaciones de dolor en las articulaciones y está implicado en los cambios adaptativos inducidos en el sistema opioide en virtud de este dolorestado.Caracterización de factores intrínsecos y extrínsecos que regulan la self-renewal/division y la diferenciación decélulas madre es crucial para determinar madre embrionarias (ES) destino de las células. Las células madre embrionarias se diferencian en múltipleslinajes hematopoyéticos durante la formación de cuerpos embrioides (EB) in vitro, que proporciona una plataforma experimental paradefinir los mecanismos moleculares que controlan la capa de germen de la determinación del destino y la formación de tejido.Métodos y resultadosEl tipo de receptor cannabinoide 1 (CB1) y receptor cannabinoide tipo 2 (CB2) son miembros de la acoplado a proteína Gfamilia de receptores (GPCR), que son activados por ligandos endógenos, los endocannabinoides. La expresión del receptor CB1 esabundante en el cerebro mientras que los receptores CB2 se expresan principalmente en las células hematopoyéticas. Sin embargo, la expresión y laNo se conocen funciones precisas de CB1 y CB2 y sus ligandos afines en células madre embrionarias. Se observó una inducción significativade CB1 y CB2 cannabinoides durante la diferenciación hematopoyética del ES de ratón (ES) de derivados embrioidecuerpos. Además, las células TEr así como los órganos embrionarios ES-derivados de los días 7 y 14, endocannabinoides expresadas,los ligandos para CB1 y CB2. Los antagonistas CB1 y CB2 (AM251 y AM630, respectivamente) inducida por células MESla muerte, lo que sugiere fuertemente que los endocannabinoides están implicados en la supervivencia de las células TEr. El tratamiento de células TErcon el ligando cannabinoide exógeno Δ9-THC resultó en el aumento de la diferenciación de las células hematopoyéticas TEr,mientras que la adición de AM251 AM630 bloqueado o formación de cuerpos embrioides derivado de las células TEr. Además,agonistas cannabinoides inducen la quimiotaxis de ES-derivados cuerpos embrioides, que fue inhibida específicamente por elCB1 y CB2 antagonistas.ConclusionesEste trabajo no se ha abordado con anterioridad y produce nueva información sobre la función de los receptores cannabinoides,CB1 y CB2, como componentes de una nueva vía regulación de la diferenciación de células ES murinas. Este estudio proporcionaconocimientos sobre la implicación del sistema cannabinoide en la supervivencia de las células ES y la diferenciación hematopoyética.IntroducciónCélulas madre embrionarias murinas (MES), derivadas de la masa celular interna de embriones preimplanted, son pluripotentes yconservar la capacidad de diferenciarse en células de las tres capas germinales del embrión de ratón en desarrollo.La comprensión de los mecanismos reguladores responsables de la diferenciación de las células hematopoyéticas TEr es crucialen la definición de las vías y los eventos moleculares que la determinación de la capa de germen de control y formación de tejido.Células ES también exhiben la capacidad de contribuir a una amplia gama de tipos de células bien definidas cuando se utiliza en variosmodelos in vitro de la diferenciación. En ensayos de diferenciación in vitro usando cultivos ES implican la extracción de la leucemiafactor inhibidor (LIF) y la separación de las células de la capa alimentadora bajo condiciones que promueven laformación de agregados de células madre embrionarias, denominada cuerpos embrioides (EB). Estos EBs contiene un número de diferentestipos de células. Los ensayos moleculares en combinación con los ensayos de diferenciación in vitro de células madre embrionarias ofrecenuna visión de los eventos moleculares tempranos asociados con especificación de linaje.Aunque la diferenciación hematopoyética in vitro de células ES se ha caracterizado tanto en el celular yniveles moleculares, las vías que regulan la diferenciación hematopoyética de células ES no están bien definidos. Las células madre embrionarias pueden ser expandidos ex vivo como células indiferenciadas que conservan un cariotipo normal o,alternativamente, pueden diferenciarse ex vivo en tipos de células de las tres capas germinales [2]. LIF es necesario paramantener el estado indiferenciado de las células ES, mientras que la retirada de LIF inicia la formación de EBS yla diferenciación celular [3], [4]. A pesar de que EBS son mucho menos organizado que el embrión real, puedenimitar parcialmente la organización espacial en el embrión. Los mecanismos de desarrollo de vascular y hematopoyéticosistemas en EBs son similares a aquellos en el saco vitelino.Miembros receptores acoplados a proteína G (GPCR) juegan un papel central en la regulación de la distribución espacial de inmadurosy las células hematopoyéticas maduras, incluyendo su liberación en la circulación y homing de tejido hematopoyético.GPCRs se han relacionado con muchas funciones, incluyendo la proliferación celular, la maduración, supervivencia, apoptosis, yla migración [9] - [12]. Los receptores CB1 y CB2 de cannabinoides son miembros de la familia GPCR. Los receptores CB2 sonexpresado principalmente en mieloide, macrófagos, eritroide, linfoide y mastocitos [13]. El receptor cannabinoide cerebroCB1 también se expresa en células hematopoyéticas tales como los linfocitos, los esplenocitos y las células T, pero la mayoría de los receptores CB1se expresan en altos niveles en el sistema nervioso central (SNC) donde regulan la atenuación de sinápticala transmisión y la psicoactividad [14] - [20]. Hasta la fecha, varios lípidos endógenos que son derivados de cadena largaLos ácidos grasos se han aislado y caracterizado como ligandos naturales, y se denominan endocannabinoides.Los endocannabinoides se sintetizan in vivo mediante diversos tejidos en la demanda a través de la escisión de los precursores de la membrana, yestán involucrados en los procesos de señalización de corto alcance [21]. Hay cuatro tipos de compuestos endógenos se han descubierto hastalejos y ha propuesto para actuar como endocannabinoides: 1) la anandamida (AEA) (N-araquidonoil-etanolamina) y algunos de susderivados, 2) 2-araquidonoilglicerol (2-AG) y éter noladin (2-araquidonoil éter de glicerol), 3) virodamina(O-araquidonoil-etanolamina), y 4) N-araquidonoil-dopamina (NADA). Desde su descubrimiento, los endocannabinoides,anandamida y 2-AG en particular, han sido implicados en las funciones fisiológicas, así como en muchos patológicacondiciones. Los endocannabinoides se han aislado del cerebro, así como a partir del bazo y otros periféricostejidos [21]. La presencia de endocannabinoides en las células hematopoyéticas e inmunes sugiere que CB2 y suligandos endógenos pueden jugar papeles fisiológicos críticos en la regulación de reacciones inflamatorias e inmunesrespuestas [22]. Sin embargo, la expresión, la función y las funciones precisas de CB1 y CB2, así como su cognadoligandos, en células ES son desconocidos.Cannabinoides naturales son los componentes de las plantas de marihuana [23]. Δ9-tetrahidrocannabinol (THC =), una de las principalesconstituyente psicoactivo de la marihuana, interactúa tanto con los receptores CB1 y CB2, provocando con ello una variedadde respuestas farmacológicas in vitro e in vivo [24]. Muchos agonistas han sido desarrollados que son selectivos para loslos receptores CB2 (JWH-015, JWH-133) CB1 (ACPA, ACEA) y tienen afinidades y significativamente más altos para un receptorsobre el otro [24] - [29]. Por otra parte, varios antagonistas que inhiben específicamente los receptores CB1 y CB2 tienenTambién se han desarrollado. La anandamida y 2-AG son ligandos endógenos, los miembros de la clase de eicosanoides de los cannabinoides,los cuales son derivados del ácido araquidónico y son estructuralmente diferentes de otras clases de cannabinoides.Se postula que el CB1 y CB2 desempeñan papeles reguladores en la diferenciación hematopoyética de células madre embrionarias y queendocannabinoides son importantes para la supervivencia de las células ES. A continuación, se analizó la expresión y función de CB1y CB2 en las células MES y determinar su papel en la diferenciación de células hematopoyéticas MES. También se analizó laexpresión de los endocannabinoides en células MES y determinó los efectos de los antagonistas cannabinoides sobre las células ES
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la supervivencia.ResultadosExpresión de los receptores CB1 y CB2 en células madre embrionarias murinas y cuerpos embrioides murinosPara examinar la expresión de receptores CB1 y CB2 en células MES, se realizó un análisis de RT-PCR en el control embrionarias indiferenciadascélulas (células ES Rosa26.6 y E14) y sobre EBs derivan de la diferenciación hematopoyética secundaria de estos dosLíneas de células ES en diferentes puntos de tiempo como se indica. Se encontró que fueron inducidos CB1 y CB2 ARNm y proteínassustancialmente en EBs diferenciada hematopoyéticas en comparación con el control de las células ES. Como se muestra en la Figura 1A y B, unaSe observó una inducción significativa de CB1 y CB2 la expresión génica en el día 8 y el día 11 hematopoyético EBS tantoRosa26.6 y E14 células madre embrionarias, mientras que las células indiferenciadas TEr tenían poca expresión de CB1 y CB2. Curiosamente,se observó expresión de CXCR4 (un miembro de la familia GPCR) en células madre embrionarias no diferenciadas y no se cambiódurante la diferenciación de células ES (Fig. 1A). También se analizaron varios marcadores hematopoyéticos en estos hematopoyéticoEBS. Se observó la inducción de la expresión de Sca-1, así como la inducción de PECAM-1 y Flk-1 de expresión durante células ESdiferenciación (Fig. 1C), que está de acuerdo con otros informes publicados [30].A continuación, CB1 y CB2 expresión de la proteína se analizó en Rosa26.6 y E14 células ES por análisis de Western blot utilizando dosdiferentes conjuntos específicos de CB1 y CB2, los anticuerpos disponibles en el mercado de Chemicon (conjunto 1) (fig. 2) y Sigma(Set 2) (datos no presentados). Ambos conjuntos específicos de CB1 y CB2 anticuerpos mostraron la inducción de receptores CB1 y CB2 proteínasexpresión durante la diferenciación celular en el día 8 y el 11 de EBS derivado de la diferenciación secundaria,demostrado por análisis de transferencia Western (Fig. 2) e inmunohistoquímica (datos no mostrados). Estos resultados mostraron que losCB1 y CB2 son tanto upregulated durante la diferenciación hematopoyética de las células ES y que implican receptores CB1 y CB2pueden tener importantes funciones reguladoras en la diferenciación de células ES.Expresión de los endocannabinoides en las células MES y cuerpos embrioides derivadas de células TEr en los días 7 y 14Para examinar si las células TEr así como EBs derivan de células TEr endocannabinoides expresas, las células fueron TEranalizados para la expresión de diversos ácidos grasos y su etanolamida y derivados de monoglicéridos utilizando LC-APCI-MS análisis [31]. Como se muestra en la Figura 3, se detectaron y se cuantificaron derivaciones de los endocannabinoides encélulas MES y EBs en días 7 y 14. El nivel de expresión de la anandamida (AEA) en las células TEr era mucho menor comoen comparación con la de 2-AG, y AEA no se detectó en absoluto en EBs en el día 7 y 14. Los niveles de expresión de: 2-AG,ácido docosahexaenoico (DHA), ácido araquidónico (AA), 2-oleoil glicerol (2-OG), ácido eicosapentaenoico (EPA), 2 -docosahexaenoil glicerol (2-DHG) y glicerol 2-eicosapentaenoyl (2-EPG), fueron abundantes en las células del MES, y EBS endías 7 y 14. Los niveles de endocannabinoides en las células madre embrionarias se correlacionaron con el número de células MES (datosno se muestra). Estos análisis mostraron que las células TEr expresan abundantemente endocannabinoides, concretamente el 2-AG, que podríaser importante para su supervivencia. Por otra parte, ya que tanto en EBs días 7 y 14 expresos endocannabinoides, esto podríasugieren que los endocannabinoides pueden desempeñar un papel en la diferenciación de las células hematopoyéticas TEr.Efectos de la exógenos y endógenos ligandos cannabinoides sobre la quimiotaxis de las células TErUna función importante del endocannabinoide 2-AG es la estimulación de la migración de los linfocitos B [32]. Desde CXCR4 ysu ligando afín SDF-1α están involucradas en la quimiotaxis de células madre hematopoyéticas, la migración y homing [33] - [45], ydesde el CXCR4, CB1 y CB2 son miembros de la familia de GPCR, por lo tanto, estudiamos si ligandos cannabinoides actúan comoagentes quimiotácticos o quimiocinéticas para las células ES. Se analizaron los efectos del ligando cannabinoide endógeno 2-AG,el ligando exógeno Δ9-THC y el agonista específico del receptor CB2, JWH-015, sobre la quimiotaxis de indiferenciadoCélulas madre embrionarias, así como el día 10 EBs derivado de la diferenciación hematopoyética secundaria.Los ensayos de quimiotaxis se realizaron utilizando Transwells Costar (Corning-Costar, Cambridge, MA). Como se muestra en la Figura 4,quimiotaxis se observó con EBs diferenciada en el día 10 en presencia de la Δ9-THC, 2-AG y JWH-015ligandos cannabinoides, mientras que la quimiotaxis de las células madre embrionarias indiferenciadas era muy baja. Esto se inhibió la quimiotaxispor los inhibidores específicos CB1 y CB2, AM251 y AM630, respectivamente. Por lo tanto, los ligandos cannabinoides, tales como 2-AG,exógena Δ9-THC y JWH-015 inducen la quimiotaxis de las células EB ES-derivados hematopoyéticas diferenciadas, mediadatanto a través de los receptores CB1 y CB2.Efectos de los inhibidores de cannabinoides en la supervivencia de las células ES RosaPara analizar los efectos de Δ9-THC sobre la supervivencia de las células Rosa ES, las células ES Rosa se dejaron sin tratar o tratados conΔ9-THC (1 M) o con los inhibidores específicos para CB1 (AM251) o CB2 (AM630) (en ausencia de Δ9-THC) para 48horas. Además, las células ES Rosa fueron tratados con DMSO (0,01%) o con metanol (0,01%) de mandos del vehículo.Después de 48 horas, las células se analizaron para la viabilidad. Como se ve en la Figura 5, no hay efectos sobre el Rosa viabilidad de células ES fueronobservado tras el tratamiento con DMSO o metanol, en comparación con las células ES tratados con cannabinoides. Δ9-THC también no teníaapoptóticos efectos sobre las células madre embrionarias Rosa. Sin embargo, ambos inhibidores (AM251 y AM630) indujo muerte celular significativaen ausencia de Δ9-THC (fig. 5). Estos resultados sugieren que los endocannabinoides, ya sea secretadas por las células ES y / opor las células de fibroblastos embrionarios primarios (PEF) de alimentación, son importantes para la supervivencia de las células ES y quela inhibición específica de estos ligandos endógenos por los inhibidores de CB1 y CB2 resultados en la apoptosis celular.Efectos de los endocannabinoides y ligandos cannabinoides exógenos sobre la diferenciación de las células TErPara examinar los efectos de los ligandos cannabinoides exógenos sobre la diferenciación de células ES, el ligando Δ9-THC (1 mM) fueañadido a las células Rosa ES en medio DMEM. El CB1 inhibidor específico AM251 (1 M) y el inhibidor específico de CB2 AM630(1 M) se utilizaron para el bloqueo de los efectos de los ligandos cannabinoides sobre la diferenciación de células ES, como se indica. LaAdemás de AM251 o AM630 o adición del vehículo de control DMSO (0,01%) o metanol (0,01%) se llevó a cabo durantela etapa de diferenciación primaria y secundaria de la diferenciación hematopoyética Rosa células ES en EBs. Células ESse preincubaron con o AM251 AM630 o con control de vehículo DMSO o metanol durante 30 min. Las células fueron luegose lavó y se cultivaron adicionalmente para la diferenciación hematopoyética in vitro en más de 14 días en la presencia o ausenciade Δ9-THC, como se describió anteriormente. El número de EBs se contó después de 14 días. Como se muestra en la Figura 6, Δ9-THC indujo unaumento en el número de EBs en comparación con las células ES de control. Sin embargo, cuando Δ9-THC se administró en elpresencia de AM251 o AM630, hubo una disminución en el número de EBs (hasta 70-75% de inhibición). Curiosamente,AM251 o solo AM630 también inhibió el número de EBs derivados de células ES (Fig. 6). Este resultado sugiere queestos inhibidores bloquean los efectos sobre EBs ES derivada de células que están mediadas por el endocannabinoide endógenoligandos, secretadas por cualquiera de las células madre embrionarias o células alimentadoras PEF, y que la inhibición de los receptores CB1 y / o CB2 receptor de-efectos mediadas por inhibidores específicos CB1 y CB2, significativamente bloques de formación de EB.DiscusiónTrabajos recientes han relacionado los cambios en la función inmune a biológicos y orientación terapéutica de los receptores cannabinoides[13]. La expresión del receptor cannabinoide ofrece un nuevo principio para la homeostasis inmune regional y la enfermedadsensibilidad, y se extiende y refina la justificación de la inmunoterapia CB2-dirigida en inmune e inflamatoriaenfermedades. Por lo tanto, la elucidación de los efectos del sistema cannabinoide (CB2-especialmente transducidas de señalización) encélulas madre auto-renovación, la proliferación y la diferenciación debe conducir a la creación de nuevas estrategias terapéuticasenfoques para trastornos hematológicos, así como estrategias novedosas que implican apoyo farmacológico para lade células madre hematopoyéticas (HSC) a base de terapias.Aquí, hemos caracterizado la expresión y función de los receptores CB1 y CB2 cannabinoides en células madre embrionarias de ratón yen ES-derivado EBS, y examinado el papel de los endocannabinoides y sus receptores afines, CB1 y CB2, como novelacomponentes de una nueva vía importante en la diferenciación de células ES murinas.Para probar la hipótesis de que los receptores CB1 yReceptores CB2 pueden tener funciones complementarias en la diferenciación hematopoyética de células madre embrionarias, que emplea ES-derivamétodos de diferenciación utilizando el ensayo de embrioides Cuerpo, que es bien controlado, fácil de manipular yfisiológicamente representante del sistema in vivo. Hemos demostrado upregulation significativo de CB1 y CB2 mRNAy proteína en hematopoyética EBS los días 8 y 11 en ambos Rosa26.6 células madre embrionarias y células E14. El agonista cannabinoideΔ9-THC y los cannabinoides inducen la quimiotaxis de EBS derivado de cualquiera Rosa26.6 o E14 células en el día 10.El tratamiento de células MES con el antagonista de CB1 cannabinoide AM251 o con antagonista cannabinoide CB2 AM630 dio como resultadoen la muerte de estas células, lo que indica la implicación de los endocannabinoides en la supervivencia celular MES. Las células ES murinasse encontraron para expresar abundancia endocannabinoides como el endocannabinoide 2-AG, que pueden jugar un papel en el MESla supervivencia celular. Además, EBs en los días 7 y 14 también endocannabinoides expresas, lo que sugiere que los endocannabinoidesmediar en la diferenciación de las células hematopoyéticas TEr, ya que los números de EBs derivadas de las células TEr fueinhibida en presencia de AM251 y AM630. Estos resultados muestran que los receptores CB1 y CB2, así como suagonistas afines, son importantes reguladores de la supervivencia celular y la diferenciación MES.La disponibilidad de las células madre proporciona nuevos enfoques para el tratamiento de enfermedades humanas. La elucidación de lamecanismos reguladores responsables de la diferenciación de células madre es crucial para la aplicación de células madre embrionarias para la salud humanaenfermedades [46]. Células ES de ratón se someten a la auto-renovación ilimitada en la presencia de la citoquina LIF, al tiempo que conservasu capacidad de diferenciación de múltiples linaje. La retirada de LIF y la agregación de las células conduce a ladiferenciación de las estructuras conocidas como cuerpos embrioides (EB). Durante la diferenciación, ciertos genes son upregulatedy varios otros son regulados a la baja de forma controlada estrechamente.En cada división de células ES, el resultado alternativa de someterse a la auto-renovación o la diferenciación se decide por elinteracción entre los factores intrínsecos y extrínsecos señales o selectiva. Sin embargo, hasta la fecha la biología intrínseca deestas células madre embrionarias siguen siendo mal definidos. Se encontró que la estimulación de células ES de auto-renovación estar restringida a LIFy citoquinas relacionadas de la familia IL-6, que la señal a través del receptor gp130 a través de JAK quinasa mediada por STAT3activación [46] - [48]. También se observó señalización PI3-quinasa para jugar un papel importante en la supervivencia celular y MESla progresión del ciclo celular [49]. Recientemente, STAT3 se informó de que el factor de transcripción aguas abajo de la tecla
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LIF/gp130 vía de señalización en las células TEr. Por otra parte, la vía de señalización de Ca2 + en las células TEr también se muestra amediar en la función celular Mes [50]. En base a los resultados, se sugiere que el sistema cannabinoide es un adicionalvía implicada en la supervivencia celular y la diferenciación MES.La mayoría de los protocolos de diferenciación dirigidas utilizar un paso inicial de agregación EB. Por lo tanto, a principios de losactividades que promueven la diferenciación en calidad que se producen dentro de la EB son en gran parte desconocidos. En base a los resultados,sugieren que los cannabinoides exógenos pueden inducir o promover la diferenciación hematopoyética. TEr células expresan CB1y los receptores CB2 y ambos receptores son funcionales. La adición de los agonistas cannabinoides selectivos exógenos aumentadala formación de cuerpos embrioides derivado de las células TEr, lo que indica que los ligandos cannabinoides inducen la hematopoyéticodiferenciación de las células a través TEr CB1 y CB2 en células TEr y células TEr EB-derivados. Curiosamente, CB2receptores se encontraron recientemente para promover el ratón proliferación de células madre neurales (SINAPROC) [47]. Agonistas cannabinoidestambién aumentó en NSCP in vitro la proliferación y la generación de neuroesfera [47].La contribución de los endocannabinoides paraneurogénesis dentro de la zona subventricular fue reconocido debido a la reducción de la proliferación de precursores neuronales enCB1 ratones knockout de receptores [47]. Por lo tanto, estas observaciones en conjunto con nuestros resultados sugieren fuertemente que ambos CB1y CB2 activación están involucrados en el mantenimiento de las células MES y que el sistema endocannabinoide es esencial endetener la supervivencia celular y la diferenciación de células madre hematopoyéticas.Materiales y MétodosCompuestos Anticuerpos y químicas y biológicasLos anticuerpos anti-CB1 y CB2 (anti-ABR-Affinity BioReagents, Golden, CO) se utilizaron para inmunomarcación. Lainmunofenotipo de CB2 se confirmó con el uso de otro anticuerpo anti-CB2 obtenida de Sigma (St. Louis,MO). Los ligandos cannabinoides Δ9-THC (THC), JWH133, metanandamida, y CP55940 también se obtuvieron de Sigma. ACEAy los antagonistas de los receptores cannabinoides AM251 y AM630 se adquirieron de Tocris (Ellisville, MO). G-CSF(Neupogen) se obtuvo de Amgen Inc. (Thousand Oaks, CA). MethoCult 03434 (para células de ratón) se obtuvo a partirStemCell Technologies (Vancouver, BC, Canadá). Los endocannabinoides deuteradas utilizados como patrones internos en elAnálisis LC-APCI-MS fueron sintetizados en el local en el Centro de Descubrimiento de Fármacos de la Universidad del Noreste (Boston,MA) siguiendo métodos informó [31].Análisis de RT-PCR de la expresión de CB1 y CB2ARN a partir de células totales TEr fue extraído utilizando el RNeasy Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA) siguiendo elel protocolo del fabricante. Una columna de centrifugación QIAshredder y la digestión DNasa se incluyeron en el procedimiento de aislamiento alimitar la posibilidad de amplificación por PCR de CB1 y CB2 a partir de ADN genómico. amplificación de cDNA y PCR fueronrealizado con el BD Biosciences TITANIO One-Step RT-PCR Kit usando 200 ng de ARN como molde para la primera hebrasíntesis. CB1 se amplificó usando los cebadores: 5'-CGT GGG CAG CCT GTT CCT CA-3 'y 5'-CAT GCG GGC TTG GTC TGG-3', el cualproducir un producto de 403 pb. CB2 se amplificó usando: 5'-CCG GAA AAG AGG ATG ATG ACG AAT-3 'y 5-CTG CTG AGC CTG GCCGAG AAC-3 ', que producen un producto de 479 pb. GAPDH se utilizó como control positivo con los cebadores: 5'-CTC ACT GGC ATGGCC TTC CG-3 'y 5'-ACC ACC CTG TTG CTG TAG CC-3', que producen un producto de 292 pb. La plantilla fue primero desnaturalizadoa 94 ° C durante 2 min seguido de 35 ciclos (94 ° C durante 30 seg, 58 ° C durante 30 seg y 68 ° C durante 1 min), seguido de 68 ° C durante2 min en un termociclador personal MyCycler (Bio-Rad Laboratories, Inc). Alícuotas (20 ml) de los productos de la PCR fueroncorrer en un gel de agarosa al 1,2% que contiene 0,5 mg / ml de bromuro de etidio.Originación de cuerpos embrionarios a partir de células madre embrionariasLa línea de células ES Rosa26.6 se obtuvo del Dr. Stuart Orkin (Hospital de Niños de la Escuela de Medicina de Harvard); El E14y E14 GFP de líneas celulares se obtuvieron de Dr. Bing Lim (Beth Israel Deaconess Medical Center, Boston). Cultura ymantenimiento de las células ES en un estado indiferenciado se realizó como se describió anteriormente [1]. Brevemente, las células madre embrionariasse mantuvieron en un PEF línea celular alimentador de ratón en medio ES que contiene medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM)con alto nivel de glucosa, factor de 10 ng / ml de inhibidor de la leucemia murina (mLIF; Chemicon International, Temecula, CA), 15%suero de ternera fetal (FCS; Hyclone, Logan, UT), 1 mM de piruvato sódico, glutamina 2 mM, aminoácido no esencial 0,1,100 mM monotioglicerol (MTG, Sigma), 50 U / ml de penicilina, y 10 mg / ml de estreptomicina. Las líneas de células ES fueronanalizado regularmente, mediante el uso de un kit de caracterización de células ES (Chemicon), para la determinación de la fosfatasa alcalinaactividad y la detección de marcadores de superficie y los factores de transcripción que se expresan por ES no diferenciadascélulas, tales como Oct-4, Rex-1, SSEA-1 y Génesis (Fox D-3).En in vitro se llevó a cabo la diferenciación hematopoyética de células ES como se describe, esencialmente de acuerdo con laprotocolo de StemCell Technologies. El método de cuerpo embrioides (EB) implica dos pasos: primero celular, esféricaagregados (denominados cuerpos embrionarios = EBS) se generan que contienen ectodermo, mesodermo y endodermoderivados (= diferenciación primaria); segundo, estos agregados se seleccionan para los precursores hematopoyéticos yampliado con factores de crecimiento tales como IL-3 e IL-6 (= diferenciación hematopoyética secundaria). Brevemente, EBS segenerado en 1% de cultivos de metilcelulosa (1 × 104 células ES por 35 mm placa de Petri). Para promover la diferenciación primariaen EBs, las células ES se cultivaron en medio de diferenciación ES que contiene medio de Dulbecco modificado de Iscove(IMDM), 15% de FCS (StemCell Technologies), glutamina 2 mM, 150 mM MTG, 40 y factor de células madre murina ng / ml (Mpc).Después de 8 días de diferenciación, el EBS se recogió y se lavó. 1 × 104 células individuales fueron sembradas en el 1%metilcelulosa del medio de diferenciación hematopoyética secundaria. 15% de FBS, 2 mM de L-glutamato, 150 mM MTG, 20%BIT (10% de BSA, 10 mg / ml de insulina, 200 g / ml de transferrina), 150 ng / ml MSCF, 30 mg / ml de IL-3, 30 mg / ml de IL-6 y 3 U / ml de Epose añadieron al cultivo para promover la diferenciación hematopoyética. Las células se procesaron para Wright-Giemsatinción, RT-PCR y Western blot análisis en diferentes momentos del EB diferenciación de la cultura, tal como se indica.Para determinar las características de los diferentes tipos de progenitores hematopoyéticos presente en el transcurso de células ESdiferenciación, EBS a partir de líneas de células ES se obtuvieron de los cultivos a días 8 y 11 (desde el día dereplating) para obtener los progenitores hematopoyéticos. Preparación Cytospin de estas células se tiñó con Wright-Giemsa y se examinan bajo un microscopio de luz. Células madre embrionarias indiferenciadas tienen un gran núcleo, citoplasma mínima,y uno o más nucleolos prominentes oscuro. Progenitoras hematopoyéticas se encuentran en EB-día 14 cultivos fueron identificados porla morfología de eritroides, megacariocitos, monocitos / macrófagos, granulocitos y células cebadas, como se analizó por microscopía de campo.
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Ensayos de quimiotaxisLos ensayos de quimiotaxis se realizaron con 5 micras de tamaño de poro y 6,5 mm de diámetro Transwells Costar (Corning-Costar,Cambridge, MA), como se describe anteriormente [30]. Las células se lavaron dos veces con solución salina equilibrada de Hank (HBSS)medio, se resuspendieron en 100 l de medio [Medio de Dulbecco modificado por Iscove (IMDM) más 0,5% de BSA] y se coloca en lacámara superior de las Transwells. En la cámara inferior, 600 l de medio con o sin ligando se colocó, comose indica. Después de 4 horas de incubación a 37 ° C y 5% de CO2, la cámara superior se retiró y el número de migranlas células se determinó utilizando un contador de células CASY / TTC. El ligando Δ9-THC (Δ9-tetrahidrocannabinol) y la endógenaligando 2-AG (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI, catálogo 62165) se añadieron a concentraciones 1 micra de medios IMDM. Laagonista específico del receptor CB2 JWH-015 (Tocris número de catálogo # 1341) también fue probado en una concentración de 1 mM. LaCB1 inhibidor específico AM251 (1 M) (Tocris número de catálogo # 1117) y el inhibidor específico CB2 AM630 (1 M)(Tocris número de catálogo # 1120) fueron utilizados para bloquear los efectos de los ligandos cannabinoides sobre la quimiotaxis de células ES. Para elestudios de inhibición, las células se preincubaron con los agonistas de inhibidor por 30 min, como se indica. SDF-1 alfa (25ng / ml) se utilizó como control positivo (PeproTech Inc., número de catálogo # 250-20A).Ensayos de supervivencia2 × 104 células Rosa ES (por pocillo de 96 pozos), CB1 y CB2 ligandos específicos, así como inhibidores se añadieron a lacultivo celular como se indica. Un 1 mM concentración final se utilizó para CP55940 (CB1 y CB2 agonistas), ACEA (CB1ligando) y JWH133 (CB2 ligando). Una concentración final 1 mM de tanto AM251 (CB1 inhibidor) y AM630 (CB2 inhibidor)se utilizó, como se indica. Las células se incubaron durante dos días en una atmósfera humidificada de CO2. El ensayo MTT fuerealizado de acuerdo con el manual de Promega (Promega Cat # G5421), y la absorbancia a 490 nm se registró entonces.Niveles de endocannabinoides en las células madre embrionariasEl procedimiento de extracción para los estándares de calibración se llevó a cabo tal como se describe [31]. Las células (células TEr, en EBsdía 7 y EBs en el día 14), a varias concentraciones, como se indica, se homogeneizaron en acetona fría: PBS, pH 7,4(31). Los homogeneizados se sometieron a ultrasonidos durante 30 segundos antes de la centrifugación a 20.800 g durante 5 minutos. La acetonaa partir de los sobrenadantes resultantes se retiró en atmósfera de nitrógeno. Para el sobrenadante restante, 50 l de PBS, un volumen deSe añadieron metanol y dos volúmenes de cloroformo para la extracción de fase líquido-líquido de los lípidos. Las dos fasesfueron separadas por centrifugación y la capa orgánica inferior se evaporó bajo nitrógeno. Las muestras de células fueronreconstituido en 50 l de etanol.El sistema utilizado para el análisis fue un TSQ Quantum Ultra espectrómetro de masas de triple cuadrupolo (Thermo Electron, SanJose, CA) con un Agilent 1100 HPLC en el extremo delantero (Agilent Technologies, Wilmington, DE). La fase móvil
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consistió en acetato de amonio 10 mM (pH 7,3 utilizando hidróxido de amonio; A) y 100% de metanol (B). La separación de cada unoanalito se logró utilizando una columna Zorbax SB-CN 2.1 × 50 mm, 5 m, 80 bis, columna (Agilent Technologies) y la elución de gradiente;el inyector automático se mantuvo a 4 ° C para evitar la degradación del analito. Picos eluidos se ionizado a través atmosféricaionización química a presión (APCI) y detectado por la transición SRM de cada analito.El análisis estadísticoLos resultados se representan como la media ± S.D. El significado de los datos se determinó mediante una prueba t de dos colas.P <0,05 fue considerado estadísticamente significativo.Fuente, gráficos y cifras: la expresión y función de los receptores cannabinoides CB1 y CB2 y sus afinesLos ligandos cannabinoides en Murino células madre embrionarias
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