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Die Cannabinoid-Rezeptoren sind eine Klasse von Rezeptoren der Zellmembran unter der G-Protein-gekoppelten Rezeptor-Superfamilie.Wie es typisch ist der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren enthalten die Cannabinoid-Rezeptoren sieben TransmembrandomänenDomänen. Cannabinoid-Rezeptoren werden durch drei große Gruppen von Liganden, Endocannabinoide (hergestellt durch das aktivierteKörper von Säugetieren), pflanzliche Cannabinoide (zB THC, der Cannabispflanze produziert) und synthetische Cannabinoide (wieals HU-210). Alle Endocannabinoide und Anlagenbau Cannabinoide sind lipophil, dh fettlöslich, Verbindungen.Derzeit gibt es zwei bekannte Subtypen bezeichnet CB1 und CB2. Der CB1-Rezeptor wird hauptsächlich im Gehirn exprimiert(Zentrales Nervensystem oder "CNS"), sondern auch in der Lunge, Leber und Nieren.Der CB2-Rezeptor exprimiert wird hauptsächlichim Immunsystem und in hämatopoetischen Zellen Montage deutet darauf hin, dass es neue CannabinoidRezeptoren, nicht-CB1 und CB2 nicht, die in Endothelzellen und im ZNS exprimiert werden. Im Jahr 2007, dieBindung mehrerer Cannabinoide an ein G-Protein-gekoppelten Rezeptor (GPCR) im Gehirn beschrieben wurde.Die Protein-Sequenzen von CB1-und CB2-Rezeptoren sind über 44% ähnlich. Wenn nur die Transmembran-Regionen derRezeptoren betrachtet werden, die Aminosäure Ähnlichkeit zwischen den beiden Subtypen etwa 68%. InZusätzlich wurden kleinere Variationen in jeden Rezeptor identifiziert. Cannabinoide binden reversibel und Stereo-selektiv an die Cannabinoid-Rezeptoren. Die Affinität eines Cannabinoid-Rezeptor bestimmt, jedem derWirkung dieser Cannabinoid. Cannabinoide, die mehr selektiv an bestimmte Rezeptoren sind wünschenswert für die medizinische Nutzung.




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 CB1Cannabinoid-Rezeptor Typ 1 (CB1)-Rezeptoren wird angenommen, dass einer der am häufigsten exprimiert G-Protein-gekoppelten seinRezeptoren im Gehirn. Dies ist auf endocannabinoid-vermittelte Depolarisation induzierte Suppression der Hemmung, einesehr verbreitete Form der kurzfristigen Plastizität bei dem der Depolarisation eines einzelnen Neurons induziert eine VerminderungGABA-vermittelten Neurotransmission. Endocannabinoide vom depolarisiert postsynaptischen Neuron binden an CB1 freigegebenRezeptoren in der präsynaptischen Neurons und zu einer Verringerung der GABA-Freisetzung.Sie sind auch in anderen Teilen des Körpers. Zum Beispiel in der Leber, wird die Aktivierung des CB1-Rezeptors bekanntde novo Lipogenese erhöhen. Aktivierung der präsynaptischen Rezeptoren CB1 ist auch bekannt, hemmen sympathischenInnervation der Blutgefäße und trägt zur Unterdrückung der neurogenen vasopressor Reaktion in septischenSchock.
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 Eine Studie über CB1-Knockout-Mäusen (gentechnisch veränderte Mäuse, die nicht produzieren kann CB1) durchgeführt wurden, zeigten eine Zunahme derSterblichkeit. Sie zeigten sich auch unterdrückt Bewegungsaktivität sowie Hypoalgesie (verminderte SchmerzenEmpfindlichkeit). Die CB1-Knockout-Mäuse haben auf Delta9-Tetrahydrocannabinol THC reagieren. Dies zeigt, dass entweder CB2 oderunbekannt Cannabinoid-Rezeptoren auch pharmakologische Bedeutung.CB2Hauptartikel: Cannabinoid-Rezeptor Typ 2CB2-Rezeptoren werden hauptsächlich auf T-Zellen des Immunsystems, auf Makrophagen und B-Zellen exprimiert wird, und inhämatopoetischen Zellen. Sie haben auch eine Funktion in Keratinocyten und auf Maus vor der Implantation ausgedrücktEmbryonen. Sie sind auch an peripheren Nervenendigungen exprimiert. Diese Rezeptoren spielen eine Rolle in Antinozizeption oderdie Linderung von Schmerzen. Im Gehirn werden sie hauptsächlich von Mikroglia-Zellen, in denen ihre Rolle bleibt unklar ausgedrückt.Während die meisten wahrscheinlich zellulären Ziele und Vollstrecker der CB2-Rezeptor-vermittelte Effekte der Endocannabinoide odersynthetische Agonisten sind die Immun-und Immun-abgeleiteten Zellen (zB Leukozyten, verschiedene Populationen von T-und BLymphozyten, Monozyten / Makrophagen, dendritische Zellen, Mastzellen, Mikroglia im Gehirn, Kupffer-Zellen in derLeber, etc.), wird die Anzahl von anderen möglichen zellulären Ziele erweitert, jetzt mit Endothel-und glattenMuskelzellen, Fibroblasten unterschiedlicher Genese, Kardiomyozyten und bestimmten neuronalen Elemente der peripheren oderZentralnervensystems.

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 AbstraktGelenkschmerzen ist ein gemeinsames klinisches Problem bei dem beide entzündliche und degenerative Gelenkerkrankungen sind wichtigeUrsachen. Der Zweck dieser Studie war es, die Rolle der CB1-und CB2-Cannabinoid-Rezeptoren in die UntersuchungVerhaltens-, histologischen und neurochemische Veränderungen mit Gelenkschmerzen verbunden. Das Mausmodell der monosodiumIodacetat (MIA) wurde verwendet, um Schmerzen in Knockout-Mäusen zu induzieren für CB1 (CB1KO) und CB2 Cannabinoid-Rezeptoren(CB2KO) und transgenen Mäusen überexprimiert CB2-Rezeptoren (CB2xP). Darüber hinaus haben wir die Änderungen induziert durch ausgewertetMIA in der Genexpression von CB1-und CB2-Cannabinoid-Rezeptoren und μ-, δ-und κ-Opioid-Rezeptoren in der LendenwirbelsäuleKabel dieser Mäuse. Wildtyp-Mäusen sowie CB1KO, CB2KO und CB2xP Mäusen entwickelte mechanische Allodynie in deripsilateralen Pfote nach MIA intraartikuläre Injektion. CB1KO und CB2KO zeigten ähnliche Niveaus der mechanischenAllodynie davon beobachtet in Wildtyp-Mäusen in der ipsilateralen Pfote, während Allodynie war deutlich abgeschwächtin CB2xP. Interessanterweise erscheint CB2KO eine kontralaterale Spiegelbild Schmerzen Entwicklung mechanischer Allodynie auchin der kontralateralen Pfote. Alle Mauslinien entwickelt ähnlichen histologischen Veränderungen nach MIA intraartikuläreInjektion. Dennoch erzeugt MIA intraartikuläre Injektion bestimmte Veränderungen in der Expression von Cannabinoidund Opioid-Rezeptor-Gene in Lendenrückenmark Abschnitten weiter moduliert durch die genetische Veränderung von warender Cannabinoid-Rezeptor-System. Diese Ergebnisse zeigten, dass CB2-Rezeptor eine dominierende Rolle in der Kontrolle spieltvon Gelenkschmerzen Manifestationen und wird in den adaptiven Veränderungen im Opioid-System gemäß dieser Schmerz induziert beteiligtZustand.Charakterisierung von innerer und äußerer Faktoren Regelung der self-renewal/division und DifferenzierungStammzellen ist von entscheidender Bedeutung bei der Bestimmung embryonale Stammzellen (ES) Zellschicksal. ES-Zellen differenzieren sich in mehrerenhämatopoetischen Linien während Embryoidkörper (EB) Bildung in vitro, die eine experimentelle Plattform bietet, umdefinieren die molekularen Mechanismen, die Keimblatt Schicksal und Bestimmung Gewebsbildung.Methoden und ErkenntnisseDer Cannabinoid-Rezeptor Typ 1 (CB1) und Cannabinoid-Rezeptor Typ 2 (CB2) sind Mitglieder der G-Protein-gekoppeltenRezeptor (GPCR)-Familie, die durch endogene Liganden, die Endocannabinoide aktiviert werden. CB1-Rezeptor-Expression istreichlich in Gehirn während CB2-Rezeptoren hauptsächlich in hämatopoetischen Zellen exprimiert werden. Jedoch bedeutet der Ausdruck undgenaue Rolle von CB1-und CB2 und ihre zugehörigen Liganden in ES-Zellen sind nicht bekannt. Wir beobachteten signifikante Induktionder CB1-und CB2-Cannabinoid-Rezeptoren während der hämatopoetischen Differenzierung muriner ES (MES)-abgeleitete embryoidEinrichtungen. Außerdem mES Zellen sowie ES-derived Embryoidkörpern an den Tagen 7 und 14, ausgedrückt Endocannabinoide,die Liganden sowohl für CB1 und CB2. Die CB1-und CB2-Antagonisten (AM251 und AM630, respectively) induzierte mES ZelleTod, was stark darauf hinweist, dass Endocannabinoide im Überleben von MES-Zellen beteiligt sind. Behandlung von MES-Zellenmit der exogenen Cannabinoid-Liganden Δ9-THC führte die erhöhte hämatopoetische Differenzierung von MES-Zellen,während die Zugabe von AM251 oder AM630 blockiert Embryoidkörperbildung von der MES-Zellen abgeleitet. ZusätzlichCannabinoidagonisten induziert die Chemotaxis von ES-abgeleiteten Embryoidkörpern, die spezifisch gehemmt durch die wurdeCB1-und CB2-Antagonisten.SchlussfolgerungenDiese Arbeit wurde bisher nicht angesprochen und liefert neue Informationen über die Funktion des Cannabinoid-Rezeptoren,CB1 und CB2, als Komponenten eines neuartigen Weg Regelung murinen ES-Zell-Differenzierung. Diese Studie liefertEinblicke in Cannabinoid-System Beteiligung in ES-Zell-Überleben und hämatopoetischen Differenzierung.EinführungMurine embryonale Stammzellen (MES)-Zellen aus der inneren Zellmasse preimplanted Embryonen gewonnen werden, pluripotente undbehalten die Fähigkeit, in Zellen aller drei Keimblätter der Maus-Embryo-Entwicklung unterscheiden.Das Verständnis der regulatorischen Mechanismen, die für die Differenzierung von hämatopoetischen Zellen mES ist entscheidendbei der Festlegung der Wege und molekularen Ereignisse, die Kontrolle Keimblatt Entschlossenheit und Gewebsbildung.ES-Zellen weisen auch die Fähigkeit, eine breite Palette von gut definierten Zelltypen beitragen, wenn Sie mehrere invitro-Modellen der Differenzierung. In vitro Differenzierung Assays mit ES Kulturen umfassen den Ausbau der Leukämieinhibierenden Faktor (LIF) und Abtrennung der Zellen aus der Feeder-Schicht unter Bedingungen, die die FörderungBildung von embryonalen Stammzellen Aggregate, sogenannte Embryoidkörpern (EVG). Diese EBs enthalten eine Reihe von verschiedenenZelltypen. Molekulare Assays in Kombination mit in-vitro-Assays Differenzierung von ES-Zellen liefernEinblicke in die frühen molekularen Ereignisse mit Linienspezifikation verbunden.Obwohl die in vitro hämatopoetische Differenzierung von ES-Zellen hat sowohl die zelluläre und charakterisiertmolekularer Ebene, die Wege, die die hämatopoetische Differenzierung von ES-Zellen zu regulieren sind nicht gut definiert. ES-Zellen können ex vivo als undifferenzierte Zellen, die einen normalen Karyotyp oder behalten ausgebautalternativ kann ex vivo in Zelltypen aller drei Keimblätter [2] unterscheiden. LIF ist erforderlich, umErhaltung des undifferenzierten Zustandes von ES-Zellen, während Rückzug der LIF initiiert die Bildung von EBs undZelldifferenzierung [3], [4]. Obwohl EBs weit weniger organisiert als die eigentliche Embryo sind, können sieteilweise imitieren die räumliche Organisation des Embryos. Die Entwicklungs-Mechanismen der vaskulären und hämatopoetischenSysteme in EBs sind ähnlich zu denen in den Dottersack.G-Protein-gekoppelten Rezeptor (GPCR) Mitglieder spielen eine zentrale Rolle bei der Regulierung der räumlichen Verteilung von unreifenund reifen hämatopoetischen Zellen, einschließlich ihrer Freisetzung in die Zirkulation und Homing auf hämatopoetische Gewebe.GPCRs haben eine Vielzahl von Funktionen, einschließlich Proliferation, Reifung, das Überleben, Apoptose und verbunden wordenMigration [9] - [12]. Die CB1-und CB2-Cannabinoid-Rezeptoren sind Mitglieder der GPCR-Familie. Die CB2-Rezeptoren sindprimär in myeloischen, Makrophagen, erythroiden, lymphoiden und Mastzellen exprimiert [13]. Das Gehirn Cannabinoid-Rezeptor-CB1 auch in hämatopoetischen Zellen, wie Lymphozyten, Milzzellen und T-Zellen exprimiert, aber meist CB1-Rezeptorenin hohen Konzentrationen in das zentrale Nervensystem (CNS) ausgedrückt werden, wobei sie die Dämpfung der synaptischen regulierenÜbertragung und Psychoaktivität [14] - [20]. Bisher mehreren endogenen Lipide, die Derivate von langkettigen sindFettsäuren wurden isoliert und als natürlichen Liganden, und werden als Endocannabinoide.Endocannabinoids werden in vivo durch verschiedene Gewebe auf Anfrage durch Spaltung der Membran Edukten synthetisieren, undsind in kurzer Reichweite Signalprozesse beteiligt [21]. Vier Arten von endogenen Verbindungen wurden so entdecktweit und vorgeschlagen worden, wie endocannabinoids handeln: 1) Anandamid (AEA) (N-Arachidonoyl-ethanolamin) und einige ihrerDerivate; 2) 2-Arachidonoylglycerol (2-AG) und Noladinäther (2-Arachidonoylglycerol Ether), 3) virodhamine(O-Arachidonoyl-Ethanolamin) und 4) N-Arachidonoyl-Dopamin (NADA). Seit ihrer Entdeckung Endocannabinoide,Anandamid und 2-AG insbesondere in physiologischen Funktionen sowie in vielen pathologischen gebrachtBedingungen. Endocannabinoids wurden isoliert aus dem Gehirn sowie aus der Milz und anderen peripherenGewebe [21]. Die Anwesenheit von Endocannabinoide in hämatopoetischen und Immunzellen legt nahe, dass CB2 und seineendogenen Liganden können kritische physiologische Rolle in der Regulation von Entzündungsreaktionen spielen und ImmunsystemAntworten [22]. Jedoch bedeutet der Ausdruck, die Funktion und die genaue Rolle von CB1-und CB2, sowie ihre zugehörigenLiganden in ES-Zellen sind unbekannt.Natürliche Cannabinoide sind die Bestandteile des Marihuana-Pflanzen [23]. Δ9-Tetrahydrocannabinol (THC =), ein großespsychoaktive Bestandteil von Marihuana, interagiert sowohl mit dem CB1-und CB2-Rezeptoren, wodurch das Auslösen einer Vielzahlvon pharmakologischen Reaktionen in vitro und in vivo [24]. Viele Agonisten wurden entwickelt, die selektiv fürder CB1 (ACPA, ACEA) und CB2 (JWH-015, JWH-133)-Rezeptoren und haben deutlich höhere Affinitäten für einen Rezeptorüber den anderen [24] - [29]. Darüber hinaus haben verschiedene Antagonisten, die spezifisch hemmen die CB1 oder CB2-Rezeptorenentwickelt worden. Anandamid und 2-AG sind endogene Liganden, die Mitglieder des Eicosanoid Klasse von Cannabinoiden,was sind Arachidonsäurederivate und unterscheiden sich strukturell von anderen Cannabinoid-Klassen.Wir vermuten, dass CB1-und CB2 regulatorische Rolle spielen in der hämatopoetischen Differenzierung von ES-Zellen, und dassEndocannabinoide sind für das Überleben von ES-Zellen wichtig. Hier untersuchten wir die Expression und Funktion CB1und CB2 in MES-Zellen bestimmt und ihre Rolle in der Zelle mES hämatopoetische Differenzierung. Wir analysierten dieAusdruck der Endocannabinoide in MES-Zellen bestimmt und die Wirkung von Cannabinoid-Antagonisten auf ES-Zell-
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Überleben.ErgebnisseExpression von CB1-und CB2 in embryonalen Stammzellen der Maus und Maus EmbryoidkörpernUm die Expression von CB1-und CB2 in MES-Zellen zu untersuchen, führten wir RT-PCR-Analyse zur Kontrolle undifferenzierten ESZellen (Rosa26.6 und E14 ES-Zellen) und auf EBs aus dem sekundären hämatopoetische Differenzierung der beiden abgeleitetES-Zellinien zu verschiedenen Zeitpunkten, wie angegeben. Wir fanden, dass CB1-und CB2-mRNAs und Proteine ​​induziert wurdenim Wesentlichen in hämatopoetischen differenzierten EBs im Vergleich zu ES-Zellen zu steuern. Wie in 1A und B, A gezeigtsignifikante Induktion von CB1-und CB2-Genexpression wurde in Tag 8 und Tag 11 hämatopoetischen EBs von beiden beobachtetRosa26.6 und E14 ES-Zellen, während undifferenzierte Zellen mES hatte wenig Ausdruck von CB1 und CB2. InteressanterweiseExpression von CXCR4 (ein Mitglied der GPCR-Familie) in differenzierten ES-Zellen beobachtet, nicht verändert wurdewährend ES-Zell-Differenzierung (Abb. 1A). Wir haben auch mehrere analysiert hämatopoetischen Marker in dieser hämatopoetischenEBs. Wir beobachteten Induktion Sca-1-Expression, sowie die Induktion von PECAM-1 und Flk-1-Expression während der ES-ZellenDifferenzierung (1C), die in Übereinstimmung mit anderen veröffentlichten Berichten ist [30].Als nächstes wurde CB1-und CB2-Proteinexpression in Rosa26.6 und E14 ES-Zellen durch Western-Blot-Analysen unter Verwendung von zwei analysiertunterschiedliche spezifische Sätze von CB1-und CB2-Antikörper, im Handel erhältlich von Chemicon (Set 1) (Fig. 2) und Sigma(Set 2) (Daten nicht gezeigt). Beide Sätze von spezifischen CB1-und CB2-Antikörper zeigte Induktion der CB1-und CB2-ProteinExpression während der ES-Zell-Differenzierung in Tag 8 und 11 EBs aus sekundären Differenzierung abgeleitet, wienachgewiesen durch Western-Blot-Analyse (Abb. 2) und Immunhistochemie (Daten nicht gezeigt). Diese Ergebnisse zeigten, dassCB1 und CB2 sind sowohl während der hämatopoetischen Differenzierung von ES-Zellen hochreguliert und implizieren, dass CB1-und CB2-kann wichtige regulatorische Rolle bei der ES-Zell-Differenzierung haben.Expression von Endocannabinoide in MES-Zellen und embryonale Körper von MES-Zellen an den Tagen 7 und 14 abgeleitetUm zu untersuchen, ob MES-Zellen sowie von EBs mES Zellen exprimieren Endocannabinoide abgeleitet waren MES-ZellenAnalyse für die Expression von verschiedenen Fettsäuren und deren Derivate ethanolamide und Monoglycerid mit LC-APCI-MS-Analyse [31]. Wie in 3 gezeigt, wurden Ableitungen der endocannabinoids erkannt und in quantifiziertMES-Zellen und EBs an den Tagen 7 und 14. Das Niveau von Anandamid (AEA)-Expression in den MES-Zellen war viel geringer alsim Vergleich zu der von 2-AG und AEA überhaupt nicht in EBs an den Tagen 7 und 14 detektiert. Die Expression von: 2-AG,Docosahexaensäure (DHA), Arachidonsäure (AA), 2-oleoyl Glycerin (2-OG), Eicosapentaensäure (EPA), 2 -Docosahexaenoyl Glycerin (2-DHG) und 2-eicosapentaenoyl Glycerin (2-EPG), waren in MES-Zellen reichlich vorhanden, und an EBsTag 7 und 14. Endocannabinoidspiegel in den embryonalen Stammzellen der Anzahl der MES-Zellen korreliert (Datennicht gezeigt). Diese Analysen zeigten, dass MES-Zellen reichlich auszudrücken Endocannabinoide, speziell 2-AG die möglicherweisewichtig für ihr Überleben. Da sowohl EBs an den Tagen 7 und 14 express Endocannabinoide, könnte dieslegen nahe, dass Endocannabinoide können eine Rolle bei der Differenzierung von hämatopoetischen Zellen mES spielen.Auswirkungen von exogenen und endogenen Cannabinoid-Liganden auf die Chemotaxis von MES-ZellenEine Hauptfunktion des 2-AG endocannabinoid ist die Stimulation der Migration in B-Lymphozyten [32]. Da CXCR4 undihre zugehörigen Liganden SDF-1α in hämatopoetischen Stammzellen Chemotaxis, Migration und Homing [33] beteiligt - [45], undseit CXCR4, CB1 und CB2 Mitglieder der GPCR-Familie sind, haben wir daher untersucht, ob Cannabinoid Liganden fungierenchemotaktische oder chemokinetische Agenten für ES-Zellen. Wir untersuchten die Wirkungen der endogenen Cannabinoid-Liganden 2-AG,die exogene Liganden Δ9-THC und die spezifische CB2-Rezeptor-Agonist, JWH-015, an der Chemotaxis von undifferenziertenES-Zellen sowie Tag 10 EBs aus sekundären hämatopoetische Differenzierung abgeleitet.Die Chemotaxis-Assays wurden unter Verwendung von Costar Transwells (Corning-Costar, Cambridge, MA). Wie in 4 gezeigt ist,Chemotaxis wurde mit differenzierten EBs am Tag 10 in Gegenwart des Δ9-THC, 2-AG und JWH-015 beobachtetCannabinoid-Liganden, während die Chemotaxis von undifferenzierten ES-Zellen war sehr gering. Diese Chemotaxis gehemmt wurdedurch den CB1-und CB2-spezifischen Inhibitoren, AM251 und AM630, beziehungsweise. Somit Cannabinoid-Liganden, wie 2-AG,exogene Δ9-THC und JWH-015 induzieren die Chemotaxis von hämatopoetischen differenzierten ES-Zellen abgeleiteten EB, vermitteltesowohl durch den CB1-und CB2-Rezeptoren.Effekte von Cannabinoid-Inhibitoren auf das Überleben von Rosa ES-ZellenUm die Auswirkungen von Δ9-THC auf das Überleben der Zellen zu analysieren Rosa ES waren die Rosa ES-Zellen unbehandelt oder mitΔ9-THC (1 &mgr; M) oder mit den spezifischen Inhibitoren für CB1 (AM251) oder CB2 (AM630) (in Abwesenheit von Δ9-THC) für 48Stunden. Darüber hinaus wurden Rosa ES-Zellen mit DMSO (0,01%) oder mit Methanol (0,01%) als Fahrzeugsteuerung behandelt.Nach 48 Stunden wurden die Zellen für die Lebensfähigkeit untersucht. Wie in Abbildung 5 zu sehen ist, ergaben sich keine Auswirkungen auf die Lebensfähigkeit der Zellen Rosa ESbeobachtet nach Behandlung mit DMSO oder Methanol als den Cannabinoid-behandelten ES-Zellen verglichen. Δ9-THC hatte auch keineapoptotische Effekte auf die Rosa-ES-Zellen. Allerdings induziert beide Inhibitoren (AM251 und AM630) signifikante Zelltodin Abwesenheit von Δ9-THC (Abb. 5). Diese Ergebnisse legen nahe, dass endocannabinoids, entweder durch ES-Zellen und / oder sezerniertdurch die primäre embryonale Fibroblasten (PEF) Feeder-Zellen sind für das Überleben von ES-Zellen und so wichtigspezifische Hemmung dieser endogenen Liganden von Inhibitoren für CB1 und CB2 Ergebnisse in Zell-Apoptose.Auswirkungen der Endocannabinoide und exogene Cannabinoid-Liganden auf die Differenzierung von MES-ZellenUm die Auswirkungen von exogenen Cannabinoid Liganden auf ES-Zell-Differenzierung, der Ligand untersuchen Δ9-THC (1 uM) warhinzugefügt, um Rosa ES-Zellen in DMEM-Medium. Der CB1-spezifischen Inhibitor AM251 (1 uM) und der CB2-spezifischen Inhibitor AM630(1 uM) wurden für die Blockierung der Wirkung von Cannabinoid-Liganden auf ES-Zell-Differenzierung, wie angegeben verwendet. DieZugabe von AM251 oder AM630 oder neben der Steuerung des Fahrzeuges DMSO (0,01%) oder Methanol (0,01%) wurde während durchgeführtdie primäre und sekundäre Differenzierung Bühne hämatopoetische Differenzierung von ES-Zellen in Rosa EBs. ES-Zellenwurden mit AM251 oder AM630 oder mit Steuerung Fahrzeug DMSO oder Methanol für 30 min vorinkubiert. Die Zellen wurden danngewaschen und weiter kultiviert für die in vitro Differenzierung hämatopoetischer über 14 Tage in Gegenwart oder Abwesenheitvon Δ9-THC, wie oben beschrieben. Die Anzahl der EBs wurde nach 14 Tagen gezählt.Wie in Abbildung 6 gezeigt Δ9-THC induziert eineErhöhung der Anzahl von EBs als in der Kontrollgruppe ES-Zellen verglichen.Allerdings, wenn Δ9-THC wurde in die verabreichteGegenwart von AM251 oder AM630, gab es eine Verringerung der Anzahl von EBs (bis zu 70-75% Hemmung). InteressanterweiseAM251 oder AM630 allein hemmte auch die Anzahl der EBs aus ES-Zellen (Abb. 6) abgeleitet. Dieses Ergebnis legt nahe, dassdiese Inhibitoren blockieren die Wirkung auf ES-Zellen abgeleiteten EBs, die durch die endogene endocannabinoid vermittelt werdenLiganden, die entweder von den ES-Zellen oder PEF Feeder-Zellen sezerniert wird, und dass die Hemmung von CB1-und / oder CB2-Rezeptorvermittelten Effekte durch spezifische CB1-und CB2-Inhibitoren signifikant Blöcke EB Bildung.DiskussionNeuere Arbeiten haben Veränderungen der Immunfunktion zu biologischen und therapeutischen Targeting von Cannabinoid-Rezeptoren verknüpft[13]. Cannabinoid-Rezeptor-Expression bietet ein neues Prinzip für die regionale Immunhomöostase und KrankheitAnfälligkeit und ergänzt und verfeinert die Gründe für CB2-gezielte Immuntherapie bei Immun-und EntzündungsreaktionenKrankheiten. Daher Aufklärung der Auswirkungen der Cannabinoid-System (insbesondere CB2-transduzierte Signal) aufStammzell-Selbsterneuerung, Proliferation und Differenzierung sollte zur Schaffung neuer therapeutischer führenAnsätze für hämatologische Erkrankungen sowie neue Strategien mit pharmakologischen Träger fürhämatopoetischen Stammzellen (HSC)-basierte Therapien.Hier haben wir die Expression und Funktion von CB1-und CB2 Cannabinoid-Rezeptoren in Maus-ES-Zellen und dadurchin ES-EBs abgeleitet und untersucht die Rolle der Endocannabinoide und ihre zugehörigen Rezeptoren CB1 und CB2, als neuartigeKomponenten eines neuen Weg wichtig in murinen ES-Zell-Differenzierung. Um die Hypothese zu testen, dass die CB1-undCB2-Rezeptoren können komplementäre Rollen in der hämatopoetischen Differenzierung von ES-Zellen haben, beschäftigten wir ES-abgeleitetenDifferenzierung Methoden mit dem Embryoidkörper Assay, der gut kontrollierten ist, leicht zu manipulieren undphysiologisch repräsentativ für die in-vivo-System. Wir zeigten eine signifikante Hochregulation von CB1-und CB2-mRNAund Protein in hämatopoetischen EBs an den Tagen 8 und 11 in beiden Rosa26.6 ES-Zellen und Zellen E14. Die Cannabinoid-AgonistΔ9-THC und die Endocannabinoide induziert die Chemotaxis von EBs entweder aus Rosa26.6 oder E14-Zellen am Tag 10 abgeleitet.Behandlung von MES-Zellen mit dem CB1-Antagonisten AM251 oder AM630 CB2 Cannabinoid-Antagonisten führtein den Tod dieser Zellen, was die Beteiligung der Endocannabinoide in mES das Überleben der Zelle. Murine ES-Zellenwurde festgestellt, dass reichlich auszudrücken Endocannabinoide einschließlich der Endocannabinoid 2-AG, die eine Rolle spielen können in mESdas Überleben der Zelle. Darüber, was darauf hindeutet EBs an den Tagen 7 und 14 auch express Endocannabinoide, dass Endocannabinoidevermitteln die hämatopoetische Differenzierung von MES-Zellen, da die Anzahl der EVG von der MES-Zellen abgeleitet warinhibiert in Gegenwart von AM251 und AM630. Diese Ergebnisse zeigen, dass sowohl CB1 und CB2-Rezeptoren, sowie ihrecognate Agonisten sind wichtige Regulatoren der mES Überleben der Zelle und Differenzierung.Die Verfügbarkeit von Stammzellen liefert neue Ansätze für die Behandlung von menschlichen Krankheiten. Aufklärung derregulatorischen Mechanismen, die Differenzierung von Stammzellen ist für die Anwendung von ES-Zellen an humane entscheidendKrankheiten [46]. Maus-ES-Zellen durchlaufen unbegrenzte Selbsterneuerung in Gegenwart des Zytokins LIF unter Beibehaltungihre Multi-Linien-Differenzierung Kapazität. Zurücknahme der LIF und Aggregation von Zellen führen, um dieDifferenzierung von Strukturen wie Embryoidkörpern (EBS) bekannt. Während der Differenzierung werden bestimmte Gene hochreguliertund einige andere sind in einer kontrollierten Art und Weise kunstvoll herunterreguliert.Bei jeder Zellteilung ES wird die alternative Ergebnis unterziehen Selbsterneuerung oder Differenzierung durch die beschlossenWechselspiel zwischen intrinsischen Faktoren und extrinsische oder selektive Signale.Allerdings sind bisher die intrinsische BiologieDiese ES-Zellen bleibt schlecht definiert. Die Stimulation der ES-Zell-Selbst-Erneuerung wurde festgestellt, dass auf LIF eingeschränkt werdenund verwandte Zytokine der IL-6-Familie, die das durch den gp130-Rezeptor über JAK-Kinase-vermittelte STAT3Aktivierung [46] - [48]. PI3-Kinase Signalgebung wurde auch beobachtet, um eine wichtige Rolle in mES Überleben der Zelle spielen undZellzyklus-Progression [49]. Vor kurzem wurde berichtet, dass STAT3 der Schlüssel nachgeschalteten Transkriptionsfaktor der sein
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 LIF/gp130 Signalweg in MES-Zellen. Darüber hinaus ist die Ca2 +-Signalweg in MES-Zellen wurde auch gezeigtvermitteln mES Zellfunktion [50]. Basierend auf unseren Ergebnissen, schlagen wir vor, dass der Cannabinoid-System ist ein zusätzlicherWeg in mES Überleben der Zelle und Differenzierung beteiligt.Die Mehrheit der gerichteten Differenzierung Protokolle verwenden eine anfängliche EB Aggregation Schritt. Daher ist die frühewirkende Differenzierung fördernden Aktivitäten sich innerhalb der EBs sind weitgehend unbekannt. Basierend auf unseren Ergebnissen sind wirdeuten darauf hin, dass exogene Cannabinoide induzieren oder fördern hämatopoetische Differenzierung. MES-Zellen exprimieren sowohl CB1und CB2-Rezeptoren und beide Rezeptoren sind funktionell. Die Zugabe von exogenen selektive Cannabinoid-Agonisten verstärktdie Embryoidkörper Bildung von MES-Zellen abgeleitet, was darauf hinweist, dass Cannabinoid-Liganden induziert die hämatopoetischenDifferenzierung von MES-Zellen durch CB1 und CB2 in beiden mES Zellen und EB-Zellen abgeleitet mES. Interessanterweise CB2Rezeptoren wurden vor kurzem festgestellt, dass Maus neurale Stammzellen Zellproliferation fördern (NSCP) [47]. Cannabinoid-Agonistenauch in vitro Proliferation und NSCP Neurosphäre Generation [47] erhöht. Der Beitrag der Endocannabinoide anNeurogenese im Subventrikularzone wurde aufgrund der geringeren Verbreitung von neuralen Vorläuferzellen in anerkanntenCB1-Rezeptor-Knockout-Mäusen [47]. Somit sind diese Beobachtungen zusammen mit unseren Ergebnisse deuten stark darauf, dass sowohl CB1und CB2 Aktivierung sind in der Wartung von MES-Zellen und die Endocannabinoidsystem ist wesentlich beteiligtStammzell-Überleben und die Differenzierung hämatopoetischen Stammzellen.Materialien und MethodenAntikörper, chemische und biologische VerbindungenAnti-CB1 und CB2 anti-Antikörper (ABR-Affinity BioReagents, Golden, CO) wurden für die Immunfärbung verwendet. DieImmunphänotypisierung CB2 wurde unter Verwendung eines anderen Anti-CB2-Antikörper von Sigma (St. Louis erhalten bestätigt,MO). Die Cannabinoid-Liganden Δ9-THC (THC), JWH133, Methanandamid und CP55940 wurden ebenfalls von Sigma erhalten. ACEAund die Cannabinoid-Rezeptor-Antagonisten AM251 und AM630 wurden aus Tocris (Ellisville, MO) gekauft. G-CSF(Neupogen) wurde von Amgen Inc. (Thousand Oaks, CA) erhalten. MethoCult 03434 (für Maus-Zellen) wurde ausStemCell Technologies (Vancouver, BC, Kanada). Die deuterierten Endocannabinoide als interne Standards in der verwendetenLC-APCI-MS-Analyse wurden in-house am Center for Drug Discovery, Northeastern University (Boston synthetisiert,MA) nach beschriebenen Verfahren [31].RT-PCR-Analyse von CB1-und CB2-ExpressionRNA aus Gesamt-MES-Zellen wurde unter Verwendung des RNeasy Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA) nach demProtokoll des Herstellers. Ein QIAshredder Spin-Säule und DNase-Verdau wurden in die Isolation Verfahren einbezogenBegrenzung der Möglichkeit der PCR-Amplifikation von CB1-und CB2 aus genomischer DNA. cDNA und PCR-Amplifikationdurchgeführt mit dem BD Biosciences TITANIUM One-Step RT-PCR Kit mit 200 ng RNA als Vorlage für die ersten StrangesSynthese. CB1 wurde unter Verwendung der Primer: 5'-CGT CAG GGG CCT CCT GTT CA-3 'und 5'-CAT GCG GGC TGG TTG GTC-3', dieergeben ein Produkt von 403 bp. CB2 wurde unter Verwendung: 5'-CCG GAA AAG AGG ATG ATG AAT GCA-3 'und 5-CTG CTG CTG AGC GCCGAG AAC-3 ', die ein Produkt von 479 bp ergeben. GAPDH wurde als positive Kontrolle mit Primer verwendet: 5'-CTC GGC ATG ACTGCC TTC CG-3 'und 5'-ACC ACC CTG CTG TTG TAG CC-3', die ein Produkt von 292 bp ergeben. Die Vorlage war zunächst denaturiertbei 94 ° C für 2 min, gefolgt von 35 Zyklen (94 ° C für 30 sec, 58 ° C für 30 sec und 68 ° C für 1 min), von 68 ° C für2 min in einem MyCycler Personal Thermal Cycler (Bio-Rad Laboratories, Inc.).Aliquots (20 ml) der PCR-Produkte wurdenlaufen auf einem 1,2% Agarosegel, enthaltend 0,5 mg / ml Ethidiumbromid.Entstehung der Embryoidkörpern aus ES-ZellenDer E14; Der Rosa26.6 ES-Zelllinie wurde von Dr. Stuart Orkin (Kinderkrankenhaus, Harvard Medical School) erhaltenund GFP-E14 Zelllinien wurden von Dr. Lim Bing (Beth Israel Deaconess Medical Center, Boston) erhalten. Kultur undWartung von ES-Zellen in einem undifferenzierten Zustand wurden wie zuvor beschrieben [1]. Kurz gesagt, ES-Zellenwurden mit einem Maus PEF Feeder-Zellinie in ES-Medium mit Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) gehaltenmit hohem Glucose, 10 ng / ml Maus-Leukämie-hemmenden Faktor (mLIF; Chemicon International, Temecula, CA), 15%fötalem Kälberserum (FCS, Hyclone, Logan, UT), 1 mM Natriumpyruvat, 2 mM Glutamin, 0,1 mM nicht-essentielle Aminosäure,100 pM Monothioglycerin (MTG; Sigma), 50 U / ml Penicillin und 10 ug / ml Streptomycin. Die ES-Zelllinienregelmäßig analysiert, unter Verwendung einer ES-Zelle Charakterisierung Kit (Chemicon) zur Bestimmung von alkalischer PhosphataseAktivität und Nachweis von Oberflächen-Markern und Transkriptionsfaktoren, die durch undifferenzierte ES ausgedrücktZellen, wie Oct-4, Rex-1, SSEA-1 und Genesis (Fox D-3).In vitro hämatopoetische Differenzierung von ES-Zellen wurde durchgeführt, wie beschrieben, im wesentlichen gemäß derProtokoll StemCell Technologies. Die Embryoidkörper (EB)-Methode erfolgt in zwei Schritten: Zunächst sphärischen ZelleAggregate (sog. Embryoidkörpern = EVG) werden erzeugt, enthalten ektodermalen, mesodermalen und endodermalenDerivate (= Primary Differenzierung), zweitens werden diese Aggregate für hämatopoetischen Vorläufer ausgewählt underweitert mit Wachstumsfaktoren, wie IL-3 und IL-6 (= Secondary hämatopoetische Differenzierung). Kurz gesagt wurden EBsgeneriert in 1% Methylcellulose Kulturen (1 × 104 ES Zellen pro 35 mm-Petrischale).Um primäre Differenzierung fördernin EBs wurden ES-Zellen in ES Differenzierung Medium Iscoves modifizierten Dulbecco-Medium(IMDM), 15% FCS (StemCell Technologies), 2 mM Glutamin, 150 pM MTG und 40 ng / ml Maus-Stammzell-Faktor (MSCF).Nach 8 Tagen Differenzierung wurden die EBs gesammelt und gewaschen. 1 × 104 einzelner Zellen wurden auf 1% ausgesätMethylcellulose aus dem sekundären hämatopoetische Differenzierung Medium. 15% FBS, 2 mM L-Glutamat, 150 uM MTG, 20%BIT (10% BSA, 10 ug / ml Insulin, 200 ug / ml Transferrin), 150 ng / ml MSCF, 30 ug / ml IL-3, 30 ug / ml IL-6 und 3 U / ml Epozu dem Kulturmedium zugegeben, um hämatopoetische Differenzierung fördern. Die Zellen wurden für Wright-Giemsa verarbeitetFärbung, RT-PCR und Western-Blot-Analysen zu verschiedenen Zeiten des EB Kulturdifferenzierung, wie angegeben.Um die Eigenschaften der verschiedenen Arten von hämatopoetischen Vorläuferzellen zu bestimmen, die während ES-ZellenDifferenzierung wurden EBs von ES-Zelllinien aus den Kulturen an den Tagen 8 und 11 gesammelt (ab dem Tag derReplattierung), um die hämatopoetischen Vorläuferzellen zu erhalten. Cytospin Herstellung dieser Zellen wurde gefärbt mit Wright-Giemsa und unter einem Lichtmikroskop. Undifferenzierten ES-Zellen haben einen großen Kern, minimal Zytoplasma,und ein oder mehrere prominente Nukleolen dunkel. Hämatopoetischen Vorläuferzellen in EB-Tag 14 Kulturen gefunden wurden identifiziertdie Morphologie erythroids, Megakaryozyten, Monozyten / Makrophagen, Granulozyten und Mastzellen, wie durch Mikroskopie analysiert.


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 Chemotaxis-AssaysDie Chemotaxis-Assays wurden unter Verwendung von 5 um-Porengröße und 6,5 mm Durchmesser Costar Transwells (Corning Costar-,Cambridge, MA), wie zuvor beschrieben [30] beschrieben. Die Zellen wurden zweimal mit Hanks Balanced Salt-Lösung (HBSS) gewaschenmedium, in 100 ul Medium [Iscoves Modified Dulbecco-Medium (IMDM) plus 0,5% BSA] resuspendiert und in dieobere Kammer der Transwells. In der unteren Kammer wurden 600 ul Medium mit oder ohne Liganden platziert, wieangegeben. Nach 4 Stunden Inkubation bei 37 ° C und 5% CO2 wurde die obere Kammer entfernt und die Anzahl der migriertenZellen wurde unter Verwendung eines CASY / TTC Zellzähler. Der Ligand Δ9-THC (Δ9-Tetrahydrocannabinol) und der endogenenLigand 2-AG (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI, Catalog # 62165) wurden bei 1 uM Konzentrationen in IMDM Medien aufgenommen. Diespezifischen CB2-Rezeptor-Agonist JWH-015 (Tocris Katalognummer # 1341) wurde ebenfalls bei einer 1 uM Konzentration getestet. DieCB1 spezifischer Inhibitor AM251 (1 uM) (Tocris Katalognummer # 1117) und der CB2 spezifischer Inhibitor AM630 (1 uM)(Tocris Katalognummer # 1120) verwendet, um die Effekte von Cannabinoid-Liganden auf ES-Chemotaxis zu blockieren. Für dieHemmung Untersuchungen wurden die Zellen mit dem Inhibitor Agonisten für 30 min vorinkubiert wie angegeben. SDF-1 alpha (25ng / ml) wurde als positive Kontrolle (PeproTech Inc., Katalognummer # 250-20A) verwendet.Survival-Assays2 × 104 Rosa ES-Zellen (pro Vertiefung 96 Vertiefungen), CB1-und CB2-spezifischen Liganden und Inhibitoren wurden zu denZellkultur, wie angegeben. A 1 pM Endkonzentration wurde CP55940 (CB1 und CB2-Agonisten) verwendet, ACEA (CB1Ligand) und JWH133 (CB2-Ligand). A 1 pM Endkonzentration von sowohl AM251 (CB1-Hemmer) und AM630 (CB2-Inhibitor)verwendet wurde, wie angegeben. Die Zellen wurden zwei Tage lang in einem befeuchteten CO 2-Atmosphäre inkubiert. Der MTT-Test warausgeführt nach dem manuellen Promega (Promega Kat. # G5421), und die Absorption bei 490 nm wurde dann aufgezeichnet.Endocannabinoidspiegel in embryonalen StammzellenDas Extraktionsverfahren für die Kalibrierstandards wurde wie beschrieben [31] durchgeführt. Cells (MES-Zellen, EBs anTag 7 und am Tag 14 EBs), in verschiedenen Konzentrationen wie angegeben, wurden in kaltem Aceton homogenisiert: PBS, pH 7.4(31). Die Homogenate wurden 30 Sekunden vor der Zentrifugation bei 20.800 g für 5 Minuten mit Ultraschall behandelt. Das AcetonAus der resultierenden Überstände wurde unter Stickstoff entfernt. Zu der verbleibenden Überstand, 50 ul PBS, einem Volumen vonMethanol und zwei Volumina Chloroform zur Flüssig-Flüssig-Flüssig-Extraktion der Lipide zugesetzt. Die beiden Phasenwurden durch Zentrifugieren getrennt und die untere organische Schicht wurde unter Stickstoff eingedampft. Die Zellproben warenrekonstituiert in 50 ul Ethanol.Das System für die Analyse wurde ein TSQ Quantum Ultra-Triple-Quadrupol-Massenspektrometer (Thermo Electron, SanJose, CA) mit einem Agilent 1100 HPLC an dem vorderen Ende (Agilent Technologies, Wilmington, DE). Die mobile Phase
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 bestand aus 10 mM Ammoniumacetat (pH 7,3 mit Ammoniumhydroxid A) und 100% Methanol (B). Trennung jedesAnalyten wurde durch die Verwendung einer Zorbax SB-CN 2.1 × 50mm, 5 um, 80a, Säule (Agilent Technologies) und Gradientelution;Der Autosampler wurde bei 4 ° C gehalten, um Analyten Abbau zu verhindern. Eluierte Peaks waren ionisierten über atmosphärischeDruck chemische Ionisation (APCI) erkannt und von jedem Analyten SRM Übergang.Statistische AnalyseDie Ergebnisse sind als Mittelwert ± Š.D. vertreten Die Bedeutung der Daten von einem zweiseitigen t-Tests bestimmt.P <0,05 wurde als statistisch signifikant.Quelle, Graphs and Figures: Expression und Funktion der Cannabinoid-Rezeptoren CB1 und CB2 und ihre verwandtenCannabinoid-Liganden in embryonalen Stammzellen der Maus