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Les récepteurs aux cannabinoïdes sont une classe de récepteurs de la membrane cellulaire dans la super-famille des récepteurs couplés aux protéines G.Comme il est typique de G récepteurs couplés aux protéines, les récepteurs cannabinoïdes contiennent couvrant sept domaines transmembranairesdomaines. Les récepteurs cannabinoïdes sont activés par trois grands groupes de ligands endocannabinoïdes (produite par lecorps de mammifères), les cannabinoïdes végétaux (comme le THC, produit par la plante de cannabis) et les cannabinoïdes synthétiques (commecomme HU-210). Tous les endocannabinoïdes et des cannabinoïdes végétaux sont lipophiles, c'est-liposolubles composés.Il existe actuellement deux sous-types connus, appelés CB1 et CB2. Le récepteur CB1 est principalement exprimé dans le cerveau(Système nerveux central ou "SNC"), mais aussi dans les poumons, le foie et les reins.Le récepteur CB2 est exprimé principalementdans le système immunitaire et les cellules hématopoïétiques de raisons de penser qu'il existe roman cannabinoïderécepteurs qui est, non CB1 et CB2 non, qui sont exprimés dans les cellules endothéliales et dans le système nerveux central. En 2007, l'liaison de plusieurs cannabinoïdes à un récepteur couplé aux protéines G (GPCR) dans le cerveau a été décrit.Les séquences protéiques de CB1 et CB2 sont environ 44% semblable. Lorsque seules les régions transmembranaires de l'récepteurs sont pris en compte, la similitude d'acides aminés entre les deux sous-types de récepteurs est d'environ 68%. Enoutre, des variations mineures dans chaque récepteur ont été identifiées. Les cannabinoïdes se lient de façon réversible et stéréode manière sélective aux récepteurs des cannabinoïdes. L'affinité d'un cannabinoïde individuelle à chaque récepteur détermine l'effet de cette cannabinoïde. Les cannabinoïdes qui se lient de manière plus sélective à certains récepteurs sont plus souhaitables pour une utilisation médicale.
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CB1
Récepteur cannabinoïde de type 1 (CB1) sont pensés pour être l'un des plus largement exprimé couplés aux protéines Gles récepteurs du cerveau. Cela est dû à endocannabinoïde médiée suppression dépolarisation induite par l'inhibition, uneforme très courante de plasticité à court terme, dans lequel la dépolarisation d'un neurone unique induit une diminutionNeurotransmission GABA-médiation. Les endocannabinoïdes libérés de la liaison de neurone post-synaptique dépolarisation de CB1récepteurs dans le neurone pré-synaptique et provoquer une diminution de la libération de GABA.Ils sont également présents dans d'autres parties du corps. Par exemple, dans le foie, l'activation du récepteur CB1 est connud'augmenter la lipogenèse de novo. L'activation des récepteurs CB1 présynaptiques est également connu pour inhiber sympathiqueinnervation des vaisseaux sanguins et contribue à la suppression de la réponse vasopressor neurogène septiquechoc.
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Une étude réalisée sur CB1 souris knock-out (souris génétiquement modifiées qui ne peuvent pas produire CB1) a montré une augmentation de laLe taux de mortalité. Ils ont également affiché l'activité locomotrice supprimé ainsi que hypoalgésie (diminution de la douleursensibilité). Les CB1 souris knock-out ne répondent à Delta9-tétrahydrocannabinol THC. Cela montre que soit CB2 ourécepteurs cannabinoïdes inconnus ont aussi une signification pharmacologique.CB2Article détaillé: récepteur cannabinoïde de type 2Récepteurs CB2 sont principalement exprimés sur les lymphocytes T du système immunitaire, sur les macrophages et les lymphocytes B, etles cellules hématopoïétiques. Ils ont aussi une fonction dans les kératinocytes, et sont exprimés en pré-implantatoire sourisembryons. Ils sont également exprimés sur les terminaisons nerveuses périphériques.Ces récepteurs jouent un rôle dans antinociception, oule soulagement de la douleur. Dans le cerveau, ils sont principalement exprimés par les cellules microgliales, où leur rôle reste flou.Bien que les cibles cellulaires les plus probables et les exécuteurs des effets médiés par le récepteur CB2 des cannabinoïdes endogènes ouagonistes synthétiques sont les cellules du système immunitaire et le système immunitaire dérivé (par exemple, les leucocytes, les différentes populations de T et Bles lymphocytes, les monocytes / macrophages, les cellules dendritiques, les mastocytes, les microglies dans le cerveau, des cellules de Kupffer dufoie, etc), le nombre d'autres cibles cellulaires potentielles est en expansion, y compris désormais endothéliale et lisseles cellules musculaires, des fibroblastes d'origines diverses, des cardiomyocytes, et certains éléments neuronaux de la périphérique ousystème nerveux central.
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RésuméLa douleur articulaire est un problème clinique commun pour lequel les deux maladies articulaires inflammatoires et dégénératives sont majeurscauses. Le but de cette étude était d'étudier le rôle des récepteurs CB1 et CB2 aux cannabinoïdes dans lealtérations comportementales, histologiques et neurochimiques associés à des douleurs articulaires. Le modèle murin de monosodiqueiodoacétate (MIA) a été utilisé pour induire des douleurs articulaires chez les souris knock-out pour CB1 (CB1KO) et les récepteurs CB2 des cannabinoïdes(CB2KO) et des souris transgéniques surexprimant les récepteurs CB2 (CB2xP). En outre, nous avons évalué les changements induits parMIA dans l'expression des gènes des récepteurs CB1 et CB2 et μ-, et δ-cannabinoïdes récepteurs κ-opioïdes dans la colonne vertébrale lombaireCordon de ces souris. Souris de type sauvage, ainsi que CB1KO, CB2KO et souris CB2xP, a développé une allodynie mécanique dans lepatte ipsilatérale après MIA injection intra-articulaire. CB1KO et CB2KO ont montré des niveaux similaires de mécaniqueallodynie de celle observée chez les souris de type sauvage dans la patte ipsilatérale, alors que l'allodynie a été significativement atténuéedans CB2xP. Fait intéressant, CB2KO affiché une image controlatéral miroir de la douleur développer allodynie mécanique aussidans la patte controlatérale. Toutes les lignées de souris développés modifications histologiques similaires après MIA intra-articulaireinjection. Néanmoins, MIA injection intra-articulaire a entraîné des changements spécifiques dans l'expression des cannabinoïdeset les gènes des récepteurs opioïdes dans les sections de la moelle épinière lombaire qui étaient davantage modulée par la modification génétique desle système de récepteur cannabinoïde. Ces résultats ont révélé que les récepteurs CB2 joue un rôle prépondérant dans le contrôledes manifestations de douleurs articulaires et est impliqué dans les changements adaptatifs induits dans le système opioïde sous cette douleurétat.
Caractérisation de facteurs intrinsèques et extrinsèques qui régissent la self-renewal/division et la différenciation desLes cellules souches est cruciale dans la détermination de la tige (ES) sort de la cellule embryonnaire. cellules souches embryonnaires se différencient en plusieurslignées hématopoïétiques pendant corps (EB) formation embryoïdes in vitro, ce qui fournit une plate-forme expérimentale dedéfinir les mécanismes moléculaires contrôlant la couche germe détermination du destin et de la formation des tissus.Méthodes et résultatsLe récepteur cannabinoïde de type 1 (CB1) et le type de récepteur cannabinoïde 2 (CB2) sont membres de l'couplé à une protéine Grécepteur (GPCR) de la famille, qui sont activés par des ligands endogènes, les endocannabinoïdes. L'expression du récepteur CB1 estabondant dans le cerveau alors que les récepteurs CB2 sont surtout exprimés dans les cellules hématopoïétiques. Toutefois, l'expression et l'rôles précis des récepteurs CB1 et CB2 et leurs ligands apparentés dans les cellules souches embryonnaires ne sont pas connus. Nous avons observé une induction significativede CB1 et CB2 récepteurs cannabinoïdes au cours de la différenciation hématopoïétique ES murines (MES) dérivé embryoïdecorps. En outre, les cellules MES ainsi que les organismes embryoid ES dérivés aux jours 7 et 14, les endocannabinoïdes exprimés,les ligands pour les deux CB1 et CB2. Les antagonistes CB1 et CB2 (AM251 et AM630, respectivement) cellulaire induite mESmort, suggérant fortement que les endocannabinoïdes sont impliqués dans la survie des cellules MES. Le traitement des cellules MESavec le ligand cannabinoïde exogène Δ9-THC a entraîné l'augmentation de la différenciation hématopoïétique des cellules MES,tandis que plus de AM251 ou AM630 bloqué la formation de corps embryoïdes dérivée des cellules MES. En outre,agonistes cannabinoïdes induit le chimiotactisme des corps embryoïdes ES-dérivés, qui a été spécifiquement inhibée par l'Antagonistes CB1 et CB2.ConclusionsCe travail n'a pas été abordé précédemment et donne de nouvelles informations sur la fonction des récepteurs cannabinoïdes,CB1 et CB2, en tant que composants d'une nouvelle voie de régulation de la différenciation des cellules ES murines. Cette étude fournitun aperçu de l'implication du système cannabinoïde dans la survie des cellules ES et différenciation hématopoïétique.PrésentationCellules murines embryonnaires souches (MES), dérivées de la masse cellulaire interne d'embryons préimplantés, sont pluripotentes etconserver la capacité de se différencier en cellules de toutes les trois couches de germe de l'embryon de souris en développement.Comprendre les mécanismes de régulation responsables de la différenciation hématopoïétique des cellules MES est crucialà définir les voies et les événements moléculaires qui contrôlent la détermination de la couche de germe et de la formation de tissu.cellules souches embryonnaires présentent également la capacité de contribuer à un large éventail de types de cellules bien définies lorsque vous utilisez plusieurs dansmodèles in vitro de la différenciation. Dans les essais de différenciation in vitro utilisant des cultures ES impliquent le retrait de la leucémiele facteur d'inhibition (FRV) et la séparation des cellules de la couche d'alimentation dans des conditions qui favorisent l'formation d'agrégats de cellules souches embryonnaires, appelée corps embryoïdes (EBS). Ces EB contient un certain nombre de différentsles types de cellules. Les analyses moléculaires, en combinaison avec des essais de différenciation in vitro de cellules ES fournissentde mieux comprendre les événements moléculaires précoces associés à la spécification de la lignée.Bien que la différenciation hématopoïétique in vitro des cellules souches embryonnaires a été caractérisé à la fois le cellulaire etniveaux moléculaires, les voies qui régulent la différenciation hématopoïétique des cellules ES sont pas bien définis. Cellules ES peuvent être amplifiées ex vivo des cellules indifférenciées qui conservent un caryotype normal ou,alternativement, peuvent être différenciées ex vivo en types de cellules des trois feuillets embryonnaires [2]. FRV est nécessaire pourmaintenir l'état indifférencié des cellules souches embryonnaires, alors que le retrait du FRV déclenche la formation d'EBS etla différenciation cellulaire [3], [4]. Même si EB sont beaucoup moins organisés que l'embryon réelle, ils peuventmimer partiellement l'organisation spatiale de l'embryon. Les mécanismes de développement des vasculaire et hématopoïétiquesystèmes de ballasts électroniques sont similaires à ceux de la vésicule ombilicale.Les membres des récepteurs couplés aux protéines G (GPCR) jouent un rôle central dans la régulation de la distribution spatiale des immatureet les cellules hématopoïétiques matures, y compris leur libération dans la circulation et homing aux tissus hématopoïétiques.RCPG ont été liés à de nombreuses fonctions, y compris la prolifération cellulaire, la maturation, la survie, l'apoptose etmigration [9] - [12]. Les récepteurs aux cannabinoïdes CB1 et CB2 sont des membres de la famille des GPCR. Les récepteurs CB2 sontprincipalement exprimée en myéloïde, macrophages, cellules érythroïdes, lymphoïdes et les mastocytes [13]. Le récepteur cannabinoïde du cerveauCB1 est également exprimée dans les cellules hématopoïétiques comme les lymphocytes, les splénocytes et les cellules T, mais surtout des récepteurs CB1sont exprimés à des niveaux élevés dans le système nerveux central (SNC), où ils régulent l'atténuation des synaptiquetransmission et psychoactivité [14] - [20]. À ce jour, plusieurs lipides endogènes qui sont des dérivés à longue chaîneLes acides gras ont été isolés et caractérisés comme ligands naturels, et sont appelées endocannabinoïdes.Les endocannabinoïdes sont synthétisés in vivo par différents tissus sur demande par clivage des précurseurs membranaires, etsont impliqués dans les processus de signalisation à courte portée [21]. Quatre types de composés endogènes ont été découvertsloin et a proposé d'agir comme endocannabinoïdes: 1) l'anandamide (AEA) (N-arachidonoyl-éthanolamine) et certains de sesdérivés, 2) 2-arachidonoylglycérol (2-AG) et de l'éther noladin (éther de glycérol 2-arachidonoyl), 3) virodhamine(O-arachidonoyl-éthanolamine) et 4) N-arachidonoyl-dopamine (NADA). Depuis leur découverte, les endocannabinoïdes,anandamide et 2-AG en particulier, ont été impliqués dans des fonctions physiologiques ainsi que dans de nombreux pathologiqueconditions. Les endocannabinoïdes ont été isolés à partir du cerveau ainsi que de la rate et d'autres périphériquestissus [21]. La présence de cannabinoïdes endogènes dans les cellules hématopoïétiques et immunitaires suggère que CB2 et sonligands endogènes peuvent jouer des rôles physiologiques essentiels dans la régulation de réactions inflammatoires et immunitairesréponses [22]. Toutefois, l'expression, la fonction et les rôles précis des récepteurs CB1 et CB2, ainsi que leur apparentéligands, dans les cellules ES sont inconnus.Cannabinoïdes naturels sont les constituants de plants de marijuana [23]. Δ9-tétrahydrocannabinol (THC =), une importanteconstituant psychoactif de la marijuana, interagit avec à la fois le CB1 et CB2, provoquant ainsi une variétédes réponses pharmacologiques in vitro et in vivo [24]. De nombreux agonistes ont été développés qui sont sélectifs pourCB1 (ACPA, ACEA) et les récepteurs CB2 (JWH-015, JWH-133) et ont significativement plus élevés affinités pour un récepteursur l'autre [24] - [29]. En outre, divers antagonistes qui inhibent spécifiquement les récepteurs CB1 ou CB2 ontégalement été développés. L'anandamide et 2-AG sont des ligands endogènes, les membres de la classe eicosanoïdes des cannabinoïdes,qui sont des dérivés de l'acide arachidonique et sont structurellement différente des autres catégories de cannabinoïdes.Nous émettons l'hypothèse que CB1 et CB2 jouent un rôle de régulation dans la différenciation hématopoïétique des cellules ES et queendocannabinoïdes jouent un rôle important pour la survie des cellules ES. Ici, nous avons examiné l'expression et la fonction des CB1et CB2 dans les cellules MES et déterminé leur rôle dans la cellule mES différenciation hématopoïétique. Nous avons également analysé l'expression des endocannabinoïdes dans les cellules MES et déterminé les effets des antagonistes des cannabinoïdes sur les cellules ES
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survie.RésultatsExpression des récepteurs CB1 et CB2 sur les cellules souches embryonnaires murines et organismes embryoid murinsPour étudier l'expression des récepteurs CB1 et CB2 dans les cellules MES, nous avons effectué une analyse par RT-PCR sur le contrôle ES indifférenciéescellules (Rosa26.6 et E14 cellules ES) et sur EbS proviennent de la différenciation hématopoïétique secondaire de ces deuxdes lignées de cellules ES à différents points dans le temps comme indiqué. Nous avons constaté que CB1 et CB2 ARNm et des protéines ont été induitessensiblement dans hématopoïétiques différenciées EB par rapport au contrôle des cellules ES. Comme le montre la figure 1A et B, uneinduction significative de l'expression du gène CB1 et CB2 a été observée dans 8 jours et 11 jours hématopoïétique EB à la foisRosa26.6 et E14 cellules ES, tandis que les cellules indifférenciées MES avaient peu d'expression des récepteurs CB1 et CB2. Fait intéressant,expression de CXCR4 (un membre de la famille GPCR) a été observée dans les cellules ES indifférenciées et n'a pas été modifiéau cours de la différenciation des cellules ES (Fig. 1A). Nous avons également analysé plusieurs marqueurs hématopoïétiques dans ces hématopoïétiqueEB. Nous avons observé l'induction de Sca-1 expression, ainsi que l'induction de PECAM-1 et Flk-1 expression pendant cellules ESdifférenciation (figure 1C), qui est en accord avec d'autres rapports publiés [30].Ensuite, expression de la protéine CB1 et CB2 a été analysée dans Rosa26.6 et E14 cellules ES par Western Blot en utilisant deuxdifférents ensembles spécifiques de CB1 et CB2 des anticorps, disponibles dans le commerce auprès de Chemicon (série 1) (Fig. 2) et Sigma(Set 2) (données non présentées). Les deux ensembles d'anticorps spécifiques CB1 et CB2 ont montré l'induction de CB1 et CB2 protéinesexpression au cours de la différenciation des cellules ES à jour 8 et 11 EB dérivé de différenciation secondaire,démontré par une analyse Western blot (Fig. 2) et immunohistochimie (données non présentées). Ces résultats ont montré queCB1 et CB2 sont tous deux régulés à la hausse au cours de la différenciation hématopoïétique des cellules ES et impliquent que CB1 et CB2peuvent avoir des rôles réglementaires importants dans la différenciation des cellules ES.Expression des endocannabinoïdes dans les cellules MES et corps embryoïdes dérivés de cellules MES à 7 et 14 joursAfin de déterminer si les cellules MES ainsi que EbS dérivées de cellules MES endocannabinoïdes express, les cellules MES étaientanalysées pour l'expression de divers acides gras et leurs dérivés éthanolamide et de monoglycérides en utilisant LC-APCI-MS analyse [31]. Comme le montre la figure 3, les dérivations des endocannabinoïdes ont été détectés et quantifiés danscellules MES et EBS aux jours 7 et 14. Le niveau d'anandamide (AEA) expression dans les cellules MES était beaucoup plus faible quepar rapport à celui du 2-AG et AEA n'a pas été détecté à l'ensemble dans l'EBS aux jours 7 et 14. Les niveaux d'expression de: 2-AG,l'acide docosahexaénoïque (DHA), l'acide arachidonique (AA), le glycérol 2-oléoyl-(2-OG), l'acide eicosapentaénoïque (EPA), 2 -glycérol docosahexaénoyle (2 DHG) et du glycérol 2 éicosapentaénoyl (2-EPG), étaient abondants dans les cellules MES, et EBSjours 7 et 14. Niveaux d'endocannabinoïdes dans les cellules souches embryonnaires ont été corrélées au nombre de cellules MES (donnéesnon représenté). Ces analyses ont montré que les cellules MES expriment abondamment endocannabinoïdes, en particulier 2-AG qui pourraitêtre important pour leur survie. En outre, puisque les deux EBS jours 7 et 14 endocannabinoïdes exprès, cela pourraitsuggèrent que les endocannabinoïdes peuvent jouer un rôle dans la différenciation des cellules hématopoïétiques MES.Effets des ligands cannabinoïdes exogènes et endogènes sur le chimiotactisme des cellules MESUne des principales fonctions de l'endocannabinoïde 2-AG est la stimulation de la migration des lymphocytes B [32]. Depuis CXCR4 etson ligand SDF-1α apparenté sont impliquées dans le chimiotactisme souches hématopoïétiques des cellules, la migration et homing [33] - [45], etdepuis CXCR4, CB1 et CB2 sont des membres de la famille GPCR, nous avons étudié donc si ligands cannabinoïdes agissent commeagents chimiotactiques ou chimiocinétique pour les cellules ES. Nous avons analysé les effets du ligand cannabinoïde endogène 2-AG,le ligand exogène Δ9-THC et l'agoniste spécifique du récepteur CB2, JWH-015, le chimiotactisme des indifférenciécellules souches embryonnaires ainsi que 10 jours EBS provenant de la différenciation hématopoïétique secondaire.Les dosages de chimiotaxie ont été effectuées à l'aide Transwells Costar (Corning-Costar, Cambridge, MA). Comme le montre la figure 4,chimiotactisme a été observée avec différenciée EBs au jour 10 en présence du Δ9-THC, 2-AG et JWH-015ligands cannabinoïdes, tandis que le chimiotactisme des cellules souches embryonnaires indifférenciées était très faible. Cette chimiotaxie a été inhibéepar les inhibiteurs spécifiques CB1 et CB2, AM251 et AM630, respectivement. Ainsi, les ligands cannabinoïdes, comme le 2-AG,exogène Δ9-THC et JWH-015 induisent le chimiotactisme des cellules ES EB dérivés différenciés hématopoïétiques, médiationà travers à la fois les récepteurs CB1 et CB2.Effets des inhibiteurs des cannabinoïdes sur la survie des cellules ES RosaPour analyser les effets du Δ9-THC sur la survie des cellules ES Rosa, les cellules ES Rosa étaient non traitées ou traitées avecΔ9-THC (1 nM) ou avec les inhibiteurs spécifiques de CB1 (AM251) ou CB2 (AM630) (en l'absence de Δ9-THC) pour 48heures. En outre, les cellules ES Rosa ont été traités avec du DMSO (0,01%) ou avec du méthanol (0,01%) que les contrôles de véhicules.Après 48 heures, les cellules ont été analysés pour leur viabilité. Comme on le voit dans la figure 5, aucun effet sur la viabilité cellulaire Rosa ES étaientobservée lors du traitement avec du DMSO ou du méthanol par rapport aux cellules ES cannabinoïde-traités. Δ9-THC a également eu aucuneeffets sur l'apoptose des cellules ES Rosa. Toutefois, les deux inhibiteurs (AM251 et AM630) la mort cellulaire induite significativeen l'absence de Δ9-THC (Fig. 5). Ces résultats suggèrent que les endocannabinoïdes, soit sécrétées par les cellules souches embryonnaires et / oupar les fibroblastes cellules nourricières primaires embryonnaires (DEP), sont importants pour la survie des cellules ES et queinhibition spécifique de ces ligands endogènes par des inhibiteurs de CB1 et CB2 des résultats dans l'apoptose cellulaire.Effets des endocannabinoïdes et les ligands cannabinoïdes exogènes sur la différenciation des cellules MESPour examiner les effets de ligands cannabinoïdes exogènes sur la différenciation des cellules ES, le ligand Δ9-THC (1 pm)ajouter aux cellules ES Rosa dans du milieu DMEM. Le CB1 inhibiteur spécifique AM251 (1 nM) et de l'inhibiteur spécifique CB2 AM630(1 M) ont été utilisés pour bloquer les effets de ligands cannabinoïdes sur la différenciation des cellules ES, comme indiqué. LeOutre des AM251 ou AM630 ou plus de la maîtrise du véhicule DMSO (0,01%) ou le méthanol (0,01%) a été réalisée au cours dele stade de différenciation primaire et secondaire différenciation hématopoïétique des cellules ES Rosa en EB. Les cellules ESont été pré-incubées avec ou AM251 AM630 ou avec témoin de DMSO du véhicule ou du méthanol pendant 30 min. Les cellules ont ensuite étéon le lave et ensuite mis en culture pour la différenciation hématopoïétique in vitro plus de 14 jours en présence ou en l'absencede Δ9-THC, tel que décrit ci-dessus. Le nombre d'EBS a été compté après 14 jours.Comme le montre la figure 6, Δ9-THC induit unel'augmentation du nombre des ballasts électroniques, par rapport aux cellules ES de contrôle. Toutefois, lorsque Δ9-THC a été administré dans leprésence d'AM251 ou AM630, il ya eu une diminution du nombre d'EBS (jusqu'à 70-75% d'inhibition). Fait intéressant,AM251 ou AM630 seul aussi inhibé le nombre d'EBS dérivée de cellules souches embryonnaires (Fig. 6). Ce résultat suggère queces inhibiteurs bloquent les effets sur les cellules ES dérivées EB qui sont médiés par l'endocannabinoïde endogèneligands, soit sécrétées par les cellules souches embryonnaires ou de cellules nourricières PEF, et que l'inhibition des récepteurs CB1 et / ou récepteur CB2-effets médiation, par des inhibiteurs spécifiques CB1 et CB2, de manière significative la formation de blocs EB.DiscussionDes travaux récents ont lié des changements dans la fonction immunitaire aux biologique et le ciblage thérapeutique des récepteurs cannabinoïdes[13]. L'expression du récepteur cannabinoïde propose un nouveau principe d'homéostasie immunitaire et les maladies régionalsensibilité et prolonge et affine la raison d'immunothérapie ciblée dans CB2-immunes et inflammatoiresmaladies. Par conséquent, l'élucidation des effets du système cannabinoïde (surtout CB2-transduction de signalisation) surcellules souches auto-renouvellement, la prolifération et la différenciation devraient aboutir à la création d'une nouvelle thérapeutiqueapproches pour les troubles hématologiques ainsi que de nouvelles stratégies impliquant un soutien pharmacologique pourcellules souches hématopoïétiques (CSH) à base de thérapies.Ici, nous avons caractérisé l'expression et la fonction des récepteurs CB1 et CB2 aux cannabinoïdes dans les cellules ES murines eten ES dérivé EBS, et examiné le rôle des endocannabinoïdes et de leurs récepteurs apparentés, CB1 et CB2, comme nouveaucomposantes d'une nouvelle voie importante dans la différenciation des cellules ES murines. Pour tester l'hypothèse selon laquelle le CB1 etRécepteurs CB2 pourraient avoir des rôles complémentaires dans la différenciation hématopoïétique des cellules ES, nous avons utilisé ES-dérivéméthodes de différenciation en utilisant le test embryoïdes du corps, ce qui est bien contrôlée, facilement manipulables etphysiologiquement représentant du système in vivo. Nous avons démontré une régulation positive importante des récepteurs CB1 et CB2 ARNmet des protéines dans hématopoïétique EBS jours 8 et 11 dans les deux Rosa26.6 cellules souches embryonnaires et les cellules E14. L'agoniste cannabinoïdeΔ9-THC et les endocannabinoïdes induit le chimiotactisme des ballasts électroniques provenant soit des cellules au jour 10 Rosa26.6 ou E14.Le traitement des cellules par mois avec le cannabinoïde CB1 antagoniste AM251 ou avec CB2 des cannabinoïdes antagoniste AM630 entraînédans la mort de ces cellules, ce qui indique l'implication des endocannabinoïdes dans la survie cellulaire MES. Cellules souches embryonnaires murinesont été trouvés à exprimer abondamment endocannabinoïdes y compris le endocannabinoïde 2-AG, qui peuvent jouer un rôle dans mESla survie des cellules. En outre, EBS à 7 et 14 jours aussi endocannabinoïdes express, ce qui suggère que les endocannabinoïdesmédiation de la différenciation hématopoïétique des cellules MES, car les numéros d'EBS dérivées des cellules MES étaitinhibée en présence d'AM251 et AM630. Ces résultats montrent que les récepteurs CB1 et CB2 à la fois, ainsi que leuragonistes apparentés, sont des régulateurs importants de la survie des cellules MES et la différenciation.La disponibilité de cellules souches offre de nouvelles approches pour le traitement de maladies humaines. L'élucidation de l'mécanismes de régulation responsables de la différenciation des cellules souches est cruciale pour l'application des cellules souches embryonnaires pour la santé humainemaladies [46]. Cellules ES de souris subissent une auto-renouvellement illimité en présence du FRV de cytokines, tout en conservantleur capacité de différenciation de lignées multiples. Retrait de FRV et l'agrégation des cellules conduit à l'différenciation des structures appelées corps embryoïdes (EBS). Au cours de la différenciation, certains gènes sont régulés à la hausseet plusieurs autres sont régulés à la baisse de façon étroitement contrôlée.A chaque division des cellules ES, le résultat alternatif de subir une auto-renouvellement ou la différenciation est décidé par leinteraction entre les facteurs intrinsèques et extrinsèques signaux ou sélective.Cependant, à ce jour, la biologie intrinsèque deces cellules souches embryonnaires restent mal définis. La stimulation des cellules ES auto-renouvellement a été trouvé à se limiter à un FRVet des cytokines connexes de l'IL-6 famille, ce signal par le récepteur gp130 via JAK kinase médiée par STAT3activation [46] - [48]. On a également observé de signalisation PI3-kinase à jouer un rôle important dans la survie des cellules MES etla progression du cycle cellulaire [49]. Récemment, STAT3 a été signalé comme étant le facteur de transcription en aval clé de l'NOUS CONTACTER VIA; walsomlab@gmail.com
Voie de signalisation dans les cellules LIF/gp130 MES. En outre, le Ca2 + voie de signalisation dans les cellules MES a également montré quemédier la fonction des cellules Mes [50]. Sur la base de nos résultats, nous suggérons que le système cannabinoïde est un supplémentairevoie impliquée dans la survie des cellules MES et la différenciation.La majorité des protocoles de différenciation dirigés utiliser une première étape d'agrégation de EB. Par conséquent, le début deagissant activités stimulant la différenciation qui se produisent à l'intérieur de l'EB sont largement inconnues. Sur la base de nos résultats, noussuggèrent que les cannabinoïdes exogènes peuvent induire ou favoriser la différenciation hématopoïétique. MES cellules expriment à la fois CB1et les récepteurs CB2 et les deux récepteurs sont fonctionnels. Ajout d'agonistes cannabinoïdes exogènes sélectifs augmentéela formation de corps embryoïdes dérivée de cellules MES, ce qui indique que ligands cannabinoïdes induit la hématopoïétiquedifférenciation des cellules MES travers CB1 et CB2 dans les cellules et les cellules MES MES EB-dérivés. Fait intéressant, CB2récepteurs ont été récemment trouvés à promouvoir neural prolifération des cellules souches de souris (CPNE) [47]. Agonistes cannabinoïdeségalement augmenté in vitro NSCP prolifération et neurosphere génération [47]. La contribution des endocannabinoïdes àneurogenèse au sein de la zone sous-ventriculaire a été reconnu en raison de la prolifération réduite des précurseurs neuraux dansCB1 souris knockout pour le récepteur [47]. Ainsi, ces observations en collaboration avec nos résultats suggèrent fortement que les deux CB1et l'activation CB2 sont impliqués dans le maintien des cellules MES et que le système endocannabinoïde est essentielendiguer la survie des cellules et cellules souches différenciation hématopoïétique.Matériel et méthodesComposés anticorps et chimiques et biologiquesLes anticorps anti-CB1 et CB2 (anti-ABR-Affinity BioReagents, Golden, CO) ont été utilisés pour immunologique. Leimmunophénotypage de CB2 a été confirmée par l'utilisation d'un autre anticorps anti-CB2 obtenu auprès de Sigma (St. Louis,MO). Les ligands cannabinoïdes Δ9-THC (THC), JWH133, méthanandamide et CP55940 ont également été obtenus auprès de Sigma. ACEAet les antagonistes des récepteurs cannabinoïdes AM251 et AM630 ont été achetés auprès Tocris (Ellisville, MO). G-CSF(Neupogen) a été obtenu à partir d'Amgen Inc. (Thousand Oaks, CA). MethoCult 03434 (pour les cellules de souris) a été obtenu à partir deStemCell Technologies (Vancouver, BC, Canada). Les endocannabinoïdes deutériés utilisés comme standards internes dans leAnalyse LC-APCI-MS ont été synthétisés en interne au Centre de découverte de médicaments, la Northeastern University (Boston,MA) à la suite signalé méthodes [31].Analyse par RT-PCR de l'expression CB1 et CB2ARN à partir de cellules totales MES été extrait en utilisant le Mini Kit RNeasy (Qiagen, Valencia, CA) suite à lale protocole du fabricant. Une colonne de QIAshredder et digestion par la DNase ont été inclus dans la procédure d'isolement delimiter la possibilité d'une amplification par PCR de CB1 et CB2 à partir d'ADN génomique. amplification d'ADNc et PCR étaientréalisée avec la BD Biosciences TITANIUM Kit RT-PCR One-Step en utilisant 200 ng d'ARN comme un modèle pour le premier brinsynthèse. CB1 a été amplifié en utilisant des amorces: 5'-CGT GGG CAG CCT GTT CCT CA-3 'et 5'-CAT GCG GGC TTG GTC TGG-3', quidonner un produit de 403 pb. CB2 a été amplifié à l'aide: 5'-CCG GAA AAG AGG ATG GCA ATG AAT-3 'et 5 CTG CTG AGC GCC CTGGAG AAC-3 ', qui donnent un produit de 479 pb. GAPDH a été utilisé comme contrôle positif avec des amorces: 5'-CCT GGC ACT ATGGCC TTC CG-3 'et 5'-ACC ACC CTG CTG TTG TAG CC-3', qui donnent un produit de 292 pb. Le modèle a d'abord été dénaturéà 94 ° C pendant 2 min suivie de 35 cycles (94 ° C pendant 30 sec, 58 ° C pendant 30 s et 68 ° C pendant 1 min), puis 68 ° C pendant2 min dans un cycleur thermique myCycler personnel (Bio-Rad Laboratories, Inc). Des portions (20 ml) des produits de PCR ont étéfonctionner sur un gel d'agarose à 1,2% contenant 0,5 mg / ml de bromure d'éthidium.Origine de corps embryoïdes à partir de cellules souches embryonnairesLa lignée de cellules ES Rosa26.6 a été obtenu auprès du Dr. Stuart Orkin (Hôpital pour enfants, Harvard Medical School); La E14et-GFP E14 lignées cellulaires ont été obtenus par le Dr Bing Lim (Beth Israel Deaconess Medical Center, Boston). Culture etentretien des cellules ES dans un état indifférencié ont été réalisées comme décrit précédemment [1]. Brièvement, les cellules ESont été maintenus sur une lignée de souris de PEF d'alimentation des cellules en milieu ES contenant le milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM)avec taux élevé de glucose, 10 ng / ml murin facteur inhibiteur de la leucémie (mLIF; Chemicon International, Temecula, CA), 15%sérum de veau foetal (FCS; Hyclone, Logan, UT), 1 mM pyruvate de sodium, 2 mM de glutamine, 0,1 mM d'acide aminé non essentiel,100 monothioglycérol uM (MTG; Sigma), 50 U / ml de pénicilline et 10 pg / ml de streptomycine. Les lignées de cellules ES ont étérégulièrement analysé, à l'aide d'un kit de caractérisation de cellules ES (Chemicon), pour la détermination de la phosphatase alcalineactivité et la détection de marqueurs de surface et des facteurs de transcription qui sont exprimées par ES indifférenciéescellules, comme Oct-4, Rex-1, l'AESS-1 et Genesis (Fox D-3).In vitro la différenciation hématopoïétique des cellules ES a été effectué comme décrit, pour l'essentiel selon l'protocole de StemCell Technologies. La méthode de corps embryoïdes (EB) comporte deux étapes: d'abord, la cellule sphériquegranulats (appelé corps embryoïdes = EB) sont générés qui contiennent ectodermique, mésodermique et endodermiquedérivés (= Différenciation primaire), d'autre part, ces agrégats sont sélectionnés pour les précurseurs hématopoïétiques etélargi avec des facteurs de croissance comme l'IL-3 et IL-6 (= différenciation hématopoïétique secondaire). En bref, EBS étaientgénérée dans 1% des cultures de méthylcellulose (1 × 104 cellules ES par 35 mm boîte de Pétri). Pour promouvoir la différenciation primairedans EBS, les cellules ES ont été cultivées dans un milieu de différenciation des ES contenant le milieu de Dulbecco modifié par Iscove(IMDM), 15% FCS (StemCell Technologies), 2 mM de glutamine, 150 um MTG, et 40 facteur de cellules souches murines ng / ml (Mscf).Après 8 jours de différenciation, l'EBS ont été collectés et lavés. 1 × 104 cellules individuelles ont été ensemencées sur 1%méthylcellulose à partir du milieu de différenciation hématopoïétique secondaire. 15% de FBS, 2 mM de L-glutamate, 150 um MTG, 20%Trépan (10% de SAB, 10 ug / ml d'insuline, 200 pg / ml de transferrine), 150 ng / ml MScF, 30 ug / ml d'IL-3, 30 ug / ml d'IL-6 et de 3 U / ml d'Epoont été ajoutés à la culture pour promouvoir la différenciation hématopoïétique. Les cellules ont été traitées pour Wright-Giemsaoccidentaux analyses par transfert à différents moments de EB différenciation de culture coloration, RT-PCR et, comme indiqué.Pour déterminer les caractéristiques des différents types de progéniteurs hématopoïétiques présentes durant cellules ESdifférenciation, EBS à partir de lignées de cellules ES ont été recueillies à partir des cultures aux jours 8 et 11 (à partir du jour dereplacage) pour obtenir les progéniteurs hématopoïétiques. Cytospin préparation de ces cellules était tachée de Wright-Giemsa et examinés sous un microscope optique. Cellules souches embryonnaires indifférenciées ont un gros noyau, le cytoplasme minimal,et un ou plusieurs nucléoles foncée proéminente. Progéniteurs hématopoïétiques trouvés dans EB-jour 14 cultures ont été identifiés parla morphologie du erythroids, les mégacaryocytes, les monocytes / macrophages, des granulocytes et des mastocytes, comme analysé par microscopie en champ.
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Dosages de chimiotaxieLes dosages de chimiotaxie ont été réalisées avec 5 um taille des pores et de 6,5 mm de diamètre Costar Transwells (Corning-Costar,Cambridge, MA), comme précédemment décrit [30]. Les cellules ont été lavées deux fois avec une solution saline équilibrée de Hank (HBSS)moyen, remises en suspension dans 100 pi de milieu [le milieu de Dulbecco modifié par Iscove (IMDM) plus 0,5% de BSA] et placé dans lechambre supérieure des Transwells. Dans la chambre basse, 600 pi de milieu avec ou sans ligand a été placé, commespécification. Après 4 heures d'incubation à 37 ° C et 5% de CO2, la Chambre haute a été retiré et le nombre de migrercellules a été déterminée en utilisant un compteur de cellules CASY / TTC. Le ligand Δ9-THC (Δ9-tétrahydrocannabinol) et l'endogèneligand 2-AG (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI, Catalog # 62165) ont été ajoutés à 1 uM concentrations dans les milieux IMDM. Leagoniste du récepteur CB2 spécifique JWH-015 (Tocris numéro de catalogue 1341) a également été testée à une concentration de 1 uM. LeCB1 inhibiteur spécifique AM251 (1 M) (Tocris numéro de catalogue 1117) et de l'inhibiteur spécifique de CB2 AM630 (1 nM)(Tocris Numéro de catalogue # 1120) ont été utilisés pour bloquer les effets de ligands cannabinoïdes sur la chimiotaxie de cellules souches embryonnaires. Pour l'études d'inhibition, les cellules ont été pré-incubées avec des agonistes des inhibiteurs pendant 30 min comme indiqué. SDF-1 alpha (25ng / ml) a été utilisé comme contrôle positif (PeproTech Inc., Numéro de catalogue n ° 250-20A).analyses de survie2 × 104 Rosa cellules ES (par puits de 96 puits), CB1 et CB2 ligands spécifiques ainsi que des inhibiteurs ont été ajoutés à laculture de cellules comme indiqué. Une concentration finale 1 uM a été utilisé pour CP55940 (CB1 et CB2 agonistes), l'ACEA (CB1ligand) et JWH133 (CB2 ligand). Une concentration finale de 1 uM de deux AM251 (CB1 inhibiteur) et AM630 (CB2 inhibiteur)a été utilisé, comme indiqué. Les cellules ont été incubées pendant deux jours dans une atmosphère humidifiée de CO2. Le test MTT étaiteffectué conformément au manuel Promega (Promega Cat # G5421), et l'absorbance à 490 nm a ensuite été enregistré.Niveaux cannabinoïdes endogènes dans les cellules souches embryonnairesLa procédure d'extraction pour les normes d'étalonnage a été réalisé comme décrit [31]. (Cellules MES, EBSjour 7 et EBS à 14 jours), à différentes concentrations, comme indiqué, ont été homogénéisés dans de l'acétone froid: PBS, pH 7,4(31). Les homogénats ont été soumis aux ultrasons pendant 30 secondes avant centrifugation à 20.800 g pendant 5 minutes. L'acétoneà partir des surnageants résultant a été éliminé sous azote. Pour le surnageant restant, 50 pl PBS, un volume deLes volumes de méthanol et de chloroforme deux ont été ajoutés pour l'extraction de phase liquide-liquide des lipides. Les deux phasesont été séparées par centrifugation et la couche organique inférieure a été évaporée sous azote. Les échantillons de cellules ont étéreconstitué dans 50 ul d'éthanol.Le système utilisé pour l'analyse était un Quantum Ultra triple spectromètre de masse quadripôle TSQ (Thermo Electron, SanJose, CA) avec un Agilent 1100 HPLC sur l'extrémité avant (Agilent Technologies, Wilmington, DE). La phase mobile
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est composée de 10 mM d'acétate d'ammonium (pH 7,3 avec de l'hydroxyde d'ammonium; A) et 100% de méthanol (B). La séparation de chaqueanalyte a été réalisé en utilisant un Zorbax SB-CN 2.1 × 50mm, 5 um, 80A, colonne (Agilent Technologies) et élution de gradient;l'échantillonneur automatique a été maintenu à 4 ° C pour éviter la dégradation de la substance à analyser. Pics élues ont été ionisé via atmosphériqueionisation chimique à pression atmosphérique (APCI) et détectée par le passage de MRS de chaque analyte.L'analyse statistiqueLes résultats sont représentés en moyenne ± Š.D. L'importance des données a été déterminée par un test t bilatéral.P <0,05 a été considérée comme statistiquement significative.Source, graphiques et figures: Expression et fonction des récepteurs cannabinoïdes CB1 et CB2 et leur apparentéesLigands cannabinoïdes dans murins cellules souches embryonnaires
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