КОНТАКТЫ VIA; walsomlab@gmail.com
Каннабиноидных рецепторов, представляют собой класс клеточных рецепторов мембраны в соответствии с G-белком рецептор суперсемейства.Как это типично для G-белком рецепторов, рецепторов каннабиноидов содержат семь трансмембранногодоменов. Каннабиноидных рецепторов, которые активируются три основные группы лигандов, эндоканиабиноиды (производстваорганизме млекопитающих), завод каннабиноиды (например, THC, выпускаемых растения каннабис) и синтетические каннабиноиды (напримеркак HU-210). Все эндоканиабиноиды и растений каннабиноиды являются липофильными, то есть жирорастворимые соединения.Существуют два известных подтипов, называемые CB1 и CB2. Рецептор CB1 экспрессируется в клетках головного мозга(Центральной нервной системы или "ЦНС"), но также в легких, печени и почек.СВ2-рецептор экспрессируется главным образомв иммунной системе и в кроветворных клеток Монтажные данные свидетельствуют о том, что есть роман каннабиноиднымрецепторов, то есть, не-CB1 и CB2 не-, которые экспрессируются в эндотелиальных клетках и в ЦНС. В 2007 годусвязывание нескольких каннабиноиды к G-белком рецептор (GPCR) в мозге была описана.Белковые последовательности CB1 и CB2 рецепторы являются около 44% подобное. Когда только трансмембранного участковРецепторы считается, аминогруппу сходство кислота двух подтипов рецепторов составляет около 68%. ВКроме того, небольшие вариации в каждом рецепторов были идентифицированы.Каннабиноиды обратимо связываются и стерео-избирательно рецепторов каннабиноидов. Сродство отдельных каннабиноидных рецепторов друг определяетэффект, что каннабиноид. Каннабиноиды, которые связывают более избирательно определенными рецепторами более желательны для медицинского использования.
КОНТАКТЫ VIA; walsomlab@gmail.com
CB1
Каннабиноидных рецепторов типа 1 (CB1) рецепторы, как полагают, является одним из наиболее широко экспрессируется G-белкомрецепторов в мозге. Это связано с эндоканнабиноидной-опосредованного деполяризации индуцированного подавления ингибированияОчень распространенной формой краткосрочного пластичности, в которых деполяризация одного нейрона вызывает снижениеГАМК-опосредованной нейротрансмиссии. Endocannabinoids освобожден от деполяризованном постсинаптических нейронов связывают с CB1рецепторов в пресинаптических нейронов и вызывают снижение высвобождение ГАМК.Они также найдены в других частях организма. Например, в печени, активация рецептора CB1 известноувеличить De Novo липогенеза. Активация пресинаптических рецепторов CB1, также известно, ингибируют симпатическуюиннервации кровеносных сосудов и способствует подавлению нейрогенного вазопрессора ответ в септическойшок.
КОНТАКТЫ VIA; walsomlab@gmail.com
Исследование, проведенное на мышах CB1 (генетически измененных мышей, которые не могут производить CB1) показали увеличениесмертности. Они также отображаются подавлены двигательную активность, а также гипоалгезия (снижение боличувствительность). CB1 мышей нокаут не ответила Delta9-тетрагидроканнабинол ТГК. Это показывает, что любой или CB2неизвестные рецепторы каннабиноидным также фармакологическое значение.CB2Основная статья: каннабиноидов типа рецепторов 2СВ2-рецепторы в основном экспрессируется на Т-клетки иммунной системы, на макрофаги и В-клетки, а вкроветворных клеток. Они также имеют функцию кератиноцитов и выражаются на мышь предимплантационнойэмбрионов. Они также выразили на периферические нервные окончания. Эти рецепторы играют важную роль в антиноцицепции, либооблегчения боли. В мозге они в основном выраженное клетки микроглии, где их роль остается неясной.Хотя наиболее вероятно клеточных мишеней и исполнителей рецептора СВ2-опосредованных последствий или эндоканиабиноидысинтетические агонисты иммунной и иммунных клеток, полученных (например, лейкоцитов, различные популяции Т-и Влимфоциты, моноциты / макрофаги, дендритные клетки, тучные клетки микроглии в мозге, клетки Купфера впечени и др.), ряд других потенциальных клеточных мишеней расширяется, включая теперь и эндотелиальных и гладкомышечныхмышечные клетки, фибробласты различного генеза, кардиомиоциты, и некоторые нейронные элементы периферической илицентральную нервную систему.
КОНТАКТЫ VIA; walsomlab@gmail.com
АбстрактныйБоль в суставах является распространенной клинической проблемой, для которой как воспалительные и дегенеративные заболевания суставов являются основнымипричинами. Целью данного исследования было изучение роли CB1 и CB2 рецепторов каннабиноидов вповеденческих, гистологических, и нейрохимические изменения, связанные с болью в суставах. Мышиной модели мононатрияиодацетата (MIA) был использован, чтобы вызвать боль в суставах в нокаут мышей CB1 (CB1KO) и CB2 рецепторов каннабиноидов(CB2KO) и трансгенных мышей сверхэкспрессирующей CB2 рецепторы (CB2xP).Кроме того, мы оценили изменения, вызванныеМВД в экспрессии гена CB1 и CB2 рецепторов каннабиноидов и μ-, δ-и κ-опиоидных рецепторов в поясничном отделе спинногоШнур этих мышей. У мышей дикого типа, а также CB1KO, CB2KO и CB2xP мышей, разработанный механической аллодинии випсилатерального лапу после MIA внутрисуставной инъекции. CB1KO и CB2KO продемонстрировал аналогичные уровни механическогоаллодинии, наблюдаемого в мышами дикого типа в ипсилатеральной лапы, тогда как аллодиния была значительно ослабленныеВ CB2xP. Интересно, CB2KO отображается зеркально противоположной боли развивается механическая аллодинию такжев контралатеральной лапу. Все мыши линии разработали аналогичные гистологические изменения после того, как МВД внутрисуставнойинъекций. Тем не менее, MIA внутрисуставной инъекции производства конкретных изменений в экспрессии каннабиноидныхи опиоидные рецепторы генов в поясничной срезов спинного мозга, которые были дополнительно модулируется генетического измененияканнабиноидов системы рецепторов. Эти результаты показали, что рецепторы CB2 играет преобладающую роль в контролесовместного проявления боли и участвует в адаптивном изменении индуцированных в опиоидные системы в соответствии с настоящим больсостоянии.
Характеристика внутренних и внешних факторов, регулирующих self-renewal/division и дифференциациистволовых клеток является решающим в определении эмбриональных стволовых (ЭС) клетки судьбы. ЭС клетки дифференцироваться во множественныегемопоэтических линий во эмбриоидном тела (EB) образование в пробирке, которая обеспечивает экспериментальной платформой дляопределить молекулярные механизмы, контролирующие слой зародыша определении судьбы и образование ткани.Методы и результатыКаннабиноидных рецепторов 1 типа (CB1) и каннабиноидных рецепторов типа 2 (CB2) являются членами G-белкомрецепторов (GPCR), семейства, которые активируются эндогенных лигандов, эндоканиабиноиды. Рецепторов CB1 выражениеобильные в то время как мозг CB2 рецепторы в основном выражаются в гемопоэтические клетки. Тем не менее, выражение иточный роли CB1 и CB2 и их родственными лигандами в ЭС клетки не известны.Мы наблюдали значительное индукцииСВ1 и СВ2 каннабиноидных рецепторов в течение гемопоэтических дифференцировки мышиных ES (MES), полученный эмбриоидныхтел. Кроме того, MES клеток, а также ES-производных эмбриональных телец на 7 и 14 день, выраженный эндоканиабиноиды,лигандов для CB1 и CB2. CB1 и CB2 антагонистов (AM251 и AM630, соответственно) ЭСК индуцированные клеткисмерти, сильно предполагая, что эндоканиабиноиды вовлечены в выживание клеток мес. Лечение ЭСКс экзогенных лигандов каннабиноидных Δ9-THC привело к увеличению кроветворной дифференциации ЭСК,в то время как добавление или AM251 AM630 заблокирован эмбриоидов тела, полученные из ЭСК. Кроме того,агонисты каннабиноидных индуцированного хемотаксиса ES-полученный эмбриоидные тела, которая была специально тормозитсяCB1 и CB2 антагонистов.ВыводыЭта работа не рассматривался ранее и дает новую информацию о функции рецепторов каннабиноидов,CB1 и CB2, как компоненты новый путь регулирующий мышиной клеточной дифференцировки ES. Это исследование даетпонимание каннабиноидным участия в системе ES выживания клеток и гемопоэтических дифференциации.ВведениеМышиные эмбриональные стволовые клеток (ЭСК), полученные из внутренней клеточной массы эмбриона preimplanted, плюрипотентны исохраняют способность дифференцироваться в клетки всех трех зародышевых листков развивающегося эмбриона мыши.Понимание нормативные механизмы, ответственные за дифференцировку гемопоэтических клеток ЭСК имеет решающее значениев определении путей и молекулярных событий, которые контролируют зародыш определения слоя и формирование тканей.ES клетки также проявляют способность вносить вклад в широкий спектр четко определенных типов клеток при использовании нескольких впробирке моделей дифференциации. В пробирке дифференциации анализов с использованием ES культур включают удаление лейкемииингибирующий фактор (LIF) и отделение клеток от фидерного слоя в условиях, обеспечивающихформирование эмбриональных агрегатов стволовых клеток, называемых эмбриональных телец (ЕВ). Эти ЭТ содержать ряд различныхтипах клеток. Молекулярного анализа в сочетании с дифференциацией в пробирке анализов ЭС клеток обеспечиваютпрояснить ранние молекулярных событий, связанных с спецификации клонов.Хотя в пробирке гемопоэтических дифференцировку ЭС клеток была охарактеризована как на клеточном имолекулярном уровнях, пути, которые регулируют дифференцировку гемопоэтических ЭС клеток четко не определены. ЭС клетки могут быть расширены исключая виво как недифференцированные клетки, которые сохраняют нормальный кариотип, или,альтернативно, могут быть дифференцированы исключая виво в типах клеток всех трех зародышевых листков [2]. LIF требуетсяподдерживать недифференцированное состояние ES-клеток, тогда как вывод LIF инициирует образование и ЭТклеточной дифференцировки [3], [4]. Даже при том, ЭТ гораздо менее организованной, чем фактическая эмбриона, они могутчастично имитируют пространственную организацию в зародыше. Механизмов развития сосудистой и кроветворнойсистем ЭТ аналогичны тем, которые в желточный мешок.G-связанных белков рецептор (GPCR) членов играют центральную роль в регуляции пространственного распределения незрелыхи зрелых гемопоэтических клеток, в том числе их выпуска в обращение и возвращение к кроветворной ткани.GPCRs были связаны с множеством функций, включая пролиферацию клеток, созревание, выживание, апоптоз имиграции [9] - [12]. CB1 и CB2 рецепторов каннабиноидов являются членами GPCR семьи. СВ2-рецепторыглавным образом выражается в миелоидных, макрофаги, эритроидного, лимфоидных и тучных клеток [13]. Рецепторов мозга каннабиноиднымCB1 также экспрессируется в кроветворные клетки, такие как лимфоциты селезенки и Т-клетки, но в основном рецепторов CB1экспрессируются на высоком уровне в центральной нервной системе (ЦНС), где они регулируют ослабление синаптическихпередачи и психоактивных [14] - [20]. На данный момент несколько эндогенных липидов, которые являются производные длинноцепочечныхжирные кислоты были выделены и охарактеризованы как природными лигандами, и называются эндоканиабиноиды.Эндоканнабиноиды синтезируются в естественных условиях на различных тканях по требованию путем расщепления мембраны прекурсоров, а такжеучаствуют в процессах сигнализации короткого диапазона [21]. Четыре типа эндогенных соединений были обнаружены такдалеко и были предложены в качестве эндоканиабиноиды: 1) анандамида (АЕА) (N-арахидоноил-этаноламина) и некоторые из егопроизводные; 2) 2-arachidonoylglycerol (2-AG) и noladin эфир (2-арахидоноилглицерина эфир), 3) virodhamine(О-арахидоноил-этаноламина) и 4) N-арахидоноил-дофамина (NADA). Со времени их открытия, эндоканнабиноиды,анандамида и 2-AG в частности, участвуют в физиологических функций, а также во многих патологическихусловиях. Эндоканнабиноиды были выделены из мозга, а также из селезенки и других периферийныхткани [21]. Наличие эндоканиабиноиды в кроветворных и иммунных клетках предполагает, что CB2 и егоэндогенных лигандов могут играть критическую физиологическую роль в регуляции воспалительных и иммунных реакцийответов [22]. Однако выражение, функции и точное роли CB1 и CB2, а также их родственнымилиганды, в ЭС клетках неизвестны.Природные каннабиноиды являются составляющими растений марихуаны [23].Δ9-тетрагидроканнабинол (THC =) основныхпсихику элемент марихуаны, взаимодействует как с CB1 и CB2 рецепторы, тем самым вызывая различныефармакологической реакции в пробирке и в естественных [24]. Многие агонисты были разработаны, которые являются селективными в отношенииCB1 (ACPA, ACEA) и CB2 (JWH-015, JWH-133) и рецепторы имеют значительно более высокий сродство к рецептору одногонад другими [24] - [29]. Кроме того, различные антагонисты, которые специфически ингибируют CB1 или CB2 рецепторыТакже были разработаны. Анандамид и 2-AG являются эндогенными лигандами, члены эйкозаноидов класс каннабиноидыкоторые являются производными арахидоновой кислоты и структурно отличаются от других классов каннабиноидных.Мы предполагаем, что CB1 и CB2 играют регуляторную роль в кроветворных дифференцировку ЭС клеток и, чтоэндоканиабиноиды важны для выживания ЭС клеток. Здесь мы исследовали экспрессию и функцию CB1и CB2 в ЭСК и определяется их роль в ЭСК клетки кроветворной дифференциации. Мы также проанализировалиВыражение эндоканнабиноидов в ЭСК и определены последствия антагонисты каннабиноидных на ЭС клеток
КОНТАКТЫ VIA; walsomlab@gmail.com
выживание.РезультатыВыражение CB1 и CB2 в мышиных эмбриональных стволовых клеток и мышиных эмбриональных телецДля изучения экспрессии CB1 и CB2 в ЭСК, мы провели анализ ОТ-ПЦР на контроле недифференцированных ESклетках (Rosa26.6 и E14 ES клетки) и на ЭТ, полученные из вторичных гемопоэтических дифференциацию этих двухES клеточных линий в различные моменты времени, как указано. Мы обнаружили, что CB1 и CB2 мРНК и белка индуцировалипо существу, в гемопоэтических дифференцированных ЭТ по сравнению с контролем ЭС клетки. Как показано на фиг.1А и B,значительная индукция CB1 и CB2 экспрессии генов наблюдался в 8-й день и 11-й день гемопоэтических ЭТ с обеихRosa26.6 и E14 ЭС клетки, в то время как недифференцированные ЭСК было мало выражение CB1 и CB2. Интересно,экспрессия CXCR4 (член семейства GPCR) наблюдалось в недифференцированные клетки ES и не был измененво время дифференцировки ЭС клеток (рис. 1а). Мы также проанализировали несколько гемопоэтических маркеров в этих гемопоэтическихEB. Мы наблюдали индукцию Sca-1 выражение, а также индукцию РЕСАМ-1 и Flk-1 экспрессии во ЭС клетокдифференциации (рис. 1в), что находится в согласии с другими опубликованных отчетов [30].Далее, CB1 и CB2 экспрессии белка была проанализирована в Rosa26.6 и E14 ЭС клетки западными блоттинга с использованием двухразличные конкретные наборы CB1 и CB2 антител, коммерчески доступные от Chemicon (набор 1) (рис. 2) и Sigma(Набор 2) (данные не показаны). Оба набора специфических антител CB1 и CB2 показали индукцию CB1 и CB2 белоквыражения во время дифференцировки клеток ES в 8-й день и 11 ЭТ которые получены из вторичных дифференциации, каксвидетельствует анализ Вестерн блоттинга (фиг. 2) и иммуногистохимии (данные не показаны). Эти результаты показали, чтоCB1 и CB2 оба активируются в течение гемопоэтических дифференцировку ЭС клеток и подразумевают, что CB1 и CB2может иметь важную регуляторную роль в дифференциации клеток ES.Выражение эндоканиабиноиды в ЭСК и эмбриональные тельца, полученные из ЭСК на 7 и 14 деньИзучить вопрос ЭСК клетки, а также ЭТ, полученных из ЭСК клетки эндоканиабиноиды Express, ЭСК клеткианализировали на экспрессию различных жирных кислот и их этаноламид и моноглицерида производных с использованием LC-APCI-MS анализ [31]. Как показано на рисунке 3, дифференцирования эндоканиабиноиды были обнаружены и количественно вЭСК клетки и ЭТ на 7 и 14 день. Уровень анандамида (АЕА) выражение в ЭСК был значительно ниже в качествепо сравнению с 2-AG, и AEA не был обнаружен на всех в ЭТ на 7 и 14 день.Уровни экспрессии: 2-АГдокозагексаеновой кислоты (DHA), арахидоновой кислоты (АА), 2-олеоил-глицерин (2-OG), эйкозапентаеновая кислота (ЭПК), 2 -докозагексаеноильную глицерина (2-DHG) и 2-eicosapentaenoyl глицерина (2-EPG), были в изобилии в ЭСК и ЭТ в7 и 14. Endocannabinoid уровней в эмбриональные стволовые клетки были соотнесены с числом ЭСК (данныене показано). Эти анализы показали, что ЭСК клетки обильно выразить эндоканиабиноиды, в частности, 2-AG которые могли быиметь важное значение для их выживания. Кроме того, так как ЭТ в дни 7 и 14 экспресс эндоканиабиноиды, это могло быпредполагают, что эндоканиабиноиды может играть роль в гемопоэтических дифференцировки клеток мес.Воздействие экзогенных и эндогенных лигандов каннабиноидных на хемотаксис ЭСКОдной из основных функций 2-AG эндоканнабиноид является стимулирование миграции в лимфоцитах [32]. Так и CXCR4его родственные лиганда SDF-1α участвуют в гемопоэтических стволовых клеток хемотаксис, миграцию и самонаведения [33] - [45], ис CXCR4, CB1 и CB2 являются членами семьи GPCR, поэтому мы изучали ли лигандов каннабиноидных выступать в качествехемотаксическими или хемокинетический агентов для ЭС клеток. Были проанализированы эффекты эндогенного лиганда каннабиноидных 2-AG,экзогенных лигандов Δ9-THC и конкретные CB2 агонистов рецептора, JWH-015, на хемотаксис недифференцированныеES-клетки, а также 10-й день ЭТ, полученные из вторичных гемопоэтических дифференциации.Хемотаксиса проводили с использованием Transwells Costar (Corning-Costar, Cambridge, MA). Как показано на фигуре 4,хемотаксис наблюдалось с дифференцированными ЭТ на 10 день в присутствии Δ9-ТНС, 2-AG и JWH-015лигандов каннабиноидных, в то время как хемотаксис недифференцированных клеток ES была очень низкой. Это хемотаксисе ингибироваласьна CB1 и CB2 специфические ингибиторы, AM251 и AM630 соответственно.Таким образом, каннабиноидных лиганды, такие как 2-AG,экзогенные Δ9-ТГК и JWH-015 вызывают хемотаксис дифференцированных гемопоэтических ES-клеток, полученных Е.Б., опосредованнаяи через CB1 и CB2 рецепторы.Эффекты каннабиноидов ингибиторов на выживание Rosa ЭС клетокДля анализа последствий Δ9-THC на выживание Rosa ЭС клетки, Роза ЭС клетки необработанные или обработанные сΔ9-ТНС (1 мкМ) или с конкретными ингибиторами CB1 (AM251) или CB2 (AM630) (в отсутствие Δ9-ТНС) в течение 48часов. Кроме того, Роза ES клетки обрабатывали ДМСО (0,01%) или с метанолом (0,01%) как транспортное средство управления.Через 48 часов клетки анализировали на выживаемость. Как показано на фигуре 5, никакого влияния на Роза жизнеспособности клеток ES не былонаблюдается при обработке ДМСО или метанола по сравнению с каннабиноидных-обработанных клеток ES. Не Δ9-THC тому же не имеетапоптоз действие на клетки ES Роза. Тем не менее, как ингибиторы (AM251 и AM630), индуцированного значительную гибель клетокв отсутствие Δ9-THC (рис. 5). Эти результаты показывают, что эндоканнабиноиды, либо выделяется ES клеток и / илина эмбриональных фибробластов Первичный (ПСВ) фидерные клетки являются важными для выживания ЭС клеток и чтоспецифическое ингибирование этих эндогенных лигандов ингибиторами для CB1 и CB2 приводит к апоптозу клетки.Эффекты эндоканнабиноидов и экзогенных лигандов каннабиноидных на дифференцировку ЭСКДля изучения влияния экзогенных лигандов каннабиноидных по ЧС дифференцировки клеток, лиганд Δ9-THC (1 мкМ)добавлено Rosa ES клеток в среде DMEM. CB1 специфический ингибитор AM251 (1 мкМ) и CB2 специфический ингибитор AM630(1 мкМ), были использованы для блокирования эффектов лигандов каннабиноидных на ЭС клеточной дифференцировки, как указано.
добавление или AM251 AM630 или добавление управления транспортным средством ДМСО (0,01%) или метанола (0,01%) проводили в течениеначальной стадии дифференциации и вторичного кроветворной дифференциации Rosa ЭС клеток в ЭТ. ЭС клеткипредварительно инкубировали в присутствии или AM251 AM630 или с контрольным ДМСО транспортного средства или метаноле в течение 30 мин.Затем клеткипромывают и далее культивировали в течение в пробирке дифференцировки гемопоэтических более 14 дней в присутствии или в отсутствиеиз Δ9-ТНС, как описано выше. Количество ЭТ подсчитывали через 14 дней. Как показано на рисунке 6, ТГК-Δ9 индуцированныхувеличение количества ЭТ по сравнению с контрольными клетками ES. Однако, когда Δ9-ТНС вводилиПрисутствие или AM251 AM630, наблюдалось снижение количества ЭТ (до 70-75% ингибирования). Интересно,AM251 или AM630 также ингибирует только количество ЭТ полученные из ЭС клеток (рис. 6). Этот результат позволяет предположить, чтоэти ингибиторы блокируют действие на ES-клеток ЭТ, которые опосредованы эндогенного эндоканнабиноиднойлигандов, выделяемый либо ЭС клетки или клетки PEF подачи, и что ингибирование CB1 и / или СВ2-рецепторопосредованный эффект, специфическими ингибиторами CB1 и CB2, значительно ЕВ блоков формирования.ОбсуждениеНедавняя работа связаны изменения в иммунной функции биологических и терапевтических таргетинга рецепторов каннабиноидов[13]. Экспрессии рецепторов каннабиноидов предлагает новый принцип региональной иммунного гомеостаза и болезнивосприимчивости, а также расширяет и уточняет обоснование CB2-целевых иммунотерапии в иммунных и воспалительныхзаболеваний. Таким образом, выяснение последствий каннабиноидных системы (особенно СВ2-трансдуцированных сигнализации) встволовых клеток к самообновлению, пролиферацию и дифференциацию должно привести к созданию новых терапевтическихподходов для гематологических расстройств, а также новые стратегии с участием фармакологической поддержкигемопоэтических стволовых клеток (ГСК) на основе терапии.Здесь мы охарактеризовали экспрессию и функцию CB1 и CB2 каннабиноидных рецепторов в мышиных ЭС клеток ив ES-полученных ЭТ, и исследовали роль эндоканиабиноиды и их родственными рецепторами CB1 и CB2, как новыеКомпоненты новый путь важно в мышиной клеточной дифференцировки ES. Для проверки гипотезы о том, что CB1 иCB2 рецепторы могут иметь взаимодополняющие роли в кроветворной дифференцировку ЭС клетки, мы использовали полученные ES-дифференциация методов, использующих эмбриоидных анализа Тело, которое есть хорошо контролируемым, легко манипулировать ифизиологически представитель Система ин виво. Мы продемонстрировали значительное усиление активности CB1 и CB2 мРНКи белка в кроветворных ЭТ в дни 8 и 11 в обоих Rosa26.6 ЭС клетки и E14 клеток.Каннабиноидов агонистыΔ9-ТГК и эндоканиабиноиды индуцированного хемотаксиса ЭТ получен либо из Rosa26.6 или E14 клетки на 10 день.Лечение ЭСК с антагонист каннабиноидных CB1 AM251 или CB2 каннабиноид AM630 антагониста привелоВ гибели этих клеток, что указывает на участие в эндоканиабиноиды выживания клеток мес. Мышиные ЭС клеткиБыло обнаружено, обильно выразить эндоканиабиноиды включая эндоканнабиноидной 2-AG, который может играть роль в МЭСвыживаемости клеток. Кроме того, ЭТ на 7 и 14 день также выражают эндоканиабиноиды, предполагая, что эндоканнабиноидыопосредуют гемопоэтических дифференцировки ЭСК, так как количество ЭТ, полученные из ЭСК былоподавляется в присутствии AM251 и AM630. Эти результаты показывают, что оба CB1 и CB2 рецепторы, а также ихродственными агонистов, являются важными регуляторами МЧС выживания и дифференцировки клеток.Наличие стволовых клеток обеспечивает новые подходы к лечению заболеваний человека. Выяснениерегуляторных механизмов, ответственных за дифференцировки стволовых клетка имеет решающее значение для применения ES-клеток человеказаболеваний [46]. ЭС клетки мыши проходить неограниченное самообновлению в присутствии цитокина LIF, сохраняя при этомих мульти-линии дифференциации мощности. Снятие LIF и агрегация клеток приводят кдифференциации структуры, известные как эмбриональные тельца (ЭТ). В процессе дифференцировки, определенные гены активируются, а несколько других подавляется в сложной контролируемым образом.На каждом делении клеток ES, альтернативный результат прохождения самообновления или дифференциацию решаетсяВзаимодействие между внутренними и внешними факторами или селективные сигналов. Однако на сегодняшний день внутренняя биологииES этих клеток остается плохо определены. Стимуляция ЭС клеток самообновлению было установлено, ограничивается LIFи родственных цитокинов из IL-6 семьи, которая сигнала через gp130 через рецептор киназы JAK-опосредованное STAT3активации [46] - [48]. PI3-киназы сигнализации наблюдалось также играть важную роль в выживании клетки МЧС ипрогрессию клеточного цикла [49]. Недавно STAT3, как сообщалось, ключ вниз по течению фактора транскрипции
КОНТАКТЫ VIA; walsomlab@gmail.com
LIF/gp130 сигнального пути в ЭСК. Кроме того, Ca2 + сигнального пути в ЭСК Было также показанопосредником ЭСК функции клеток [50]. Основываясь на наших данных мы полагаем, что каннабиноидов системы является дополнительнымпути, участвующие в ЭСК выживания и дифференцировки клеток.Большинство направлены протоколы дифференцировки использовать начальный шаг агрегации EB. Таким образом, раннегодействующие дифференциации мероприятий, способствующих укреплению, происходящие внутри ЭТ в значительной степени неизвестны. Исходя из наших результатов, мыпредположить, что экзогенные каннабиноиды могут вызывать или содействовать кроветворной дифференциации. ЭСК клеток имеют и CB1и CB2 рецепторы и обоими рецепторами являются функциональными.Добавление экзогенного селективные агонисты каннабиноидных дополненыэмбриоидов тела, полученные из ЭСК, указывая, что лигандов каннабиноидных индуцированных гемопоэтическихдифференцировки ЭСК через CB1 и CB2 в обоих ЭСК и EB-полученные ЭСК клетки. Интересно, что CB2рецепторы были недавно найдены в целях содействия распространению мыши нейронных стволовых клеток (НМТП) [47]. Агонисты каннабиноидныхтакже увеличился в пробирке НМТП пролиферации и нейросфер поколения [47].Вклад в эндоканиабиноидынейрогенез в субвентрикулярной зоне была признана в связи с уменьшением распространения нейронных предшественников вCB1 рецепторов нокаут мышей [47]. Таким образом, эти наблюдения вместе с нашими результаты убедительно показывают, что оба CB1и CB2 активации участвуют в поддержании ЭСК и что эндоканнабиноид системы имеет важное значение востановить выживания клеток и стволовых клеток кроветворной дифференциации.Материалы и методыАнтитела, химических и биологических соединенийАнти-CB1 и CB2 анти-антител (ABR-Affinity биореагентов, Golden, CO) были использованы для иммунной окраски.
иммунофенотипирования CB2 была подтверждена с использованием другого анти-CB2 антитела, полученного от Sigma (St. Louis,МО). Лигандов каннабиноидных Δ9-ТГК (ТГК), JWH133, methanandamide и CP55940 были также получены от Sigma. ACEAи антагонисты каннабиноидных рецепторов AM251 и AM630 были приобретены у Tocris (Ellisville, MO). G-CSF(Neupogen) получали из Amgen Инк (Thousand Oaks, CA). MethoCult 03434 (в мышиных клетках) получали изStemCell технологий (Ванкувер, Британская Колумбия, Канада).Дейтерированного эндоканиабиноиды использовали в качестве внутреннего стандартаLC-APCI-MS анализа были синтезированы в доме в Центре для открытия новых лекарств, Северо-Восточного университета (Бостон,MA) в соответствии с известными способами [31].RT-PCR анализ CB1 и CB2 выражениеРНК из общего ЭСК экстрагировали использованием RNeasy Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA) в соответствиипроизводителя протокола. Колонка QIAshredder спина и переваривание ДНКазой были включены в изоляции процедуруограничить возможность ПЦР-амплификации CB1 и CB2 из геномной ДНК. кДНК и ПЦР-амплификации быливыполнены с BD Biosciences ТИТАНА One-Step RT-PCR Kit использованием 200 нг РНК в качестве матрицы для первой нитисинтеза. CB1 амплифицировали с использованием праймеров: 5'-GGG CAG CGT CCT GTT CCT CA-3 'и 5'-CAT GCG GGC TTG TGG GTC-3', которыйполучить продукт из 403 пар оснований. CB2 амплифицировали с использованием 5'-CCG AAG GAA AGG ATG GCA AAT ATG-3 'и 5'-CTG CTG GCC AGC CTGAAC GAG-3 ', которые дают продукт 479 п.н.. GAPDH были использованы в качестве положительного контроля с использованием праймеров: 5'-CTC ACT ATG GGCGCC TTC CG-3 'и 5'-ACC ACC TTG CTG CTG TAG CC-3', которые дают продукт из 292 пар оснований. Шаблон был первым денатурированнымпри 94 ° С в течение 2 мин, затем 35 циклов (94 ° C в течение 30 сек, 58 ° С в течение 30 сек и 68 ° С в течение 1 мин), затем 68 ° С в течение2 мин в myCycler личной Термоциклер (Bio-Rad Laboratories, Inc.) Аликвоты (20 мл) продуктов ПЦРработать на 1,2% агарозном геле, содержащем 0,5 мг / мл бромида этидия.Возникновение эмбриональных телец из ЭС клетокRosa26.6 ES клеточная линия была получена из доктор Стюарт Оркин (детская больница, Гарвардской медицинской школы); E14и GFP-E14 клеточные линии были получены от доктора Ссылок Лим (Beth Israel Deaconess Medical Center, Бостон). Культуры иподдержание ES-клеток в недифференцированном состоянии проводили, как описано ранее [1]. Вкратце, ЭС клеткиподдерживали на питатель мышь PEF линии клеток в среде для ЭС содержащей среде Игла, модифицированной Дульбекко (DMEM)с высоким содержанием глюкозы, 10 нг / мл мышиного фактора, ингибирующего лейкоз (mLIF; Chemicon International, Temecula, CA), 15%фетальной сыворотки теленка (FCS; Hyclone, Logan, UT), 1 мМ пирувата натрия, 2 мМ глутамина, 0,1 мМ несущественные аминокислоты100 мкМ монотиоглицерин (MTG, Sigma), 50 Ед / мл пенициллина и 10 мкг / мл стрептомицина. Линии ЭСК былирегулярно анализируются, используя характеристики ЭС клеток комплект (Chemicon), для определения щелочной фосфатазыактивности и обнаружение поверхностных маркеров и транскрипционных факторов, которые экспрессируется недифференцированными ESклетки, такие как Oct-4, Rex-1, SSEA-1 и Genesis (Fox D-3).В пробирке гемопоэтических дифференцировку ЭС клеток проводили, как описано, по существу, согласноПротокол StemCell Technologies. Эмбриональные тела (EB) метод включает в себя два этапа: сначала, сферические ячейкиагрегатов (называемых эмбриональных телец = EBS) генерируются, которые содержат эктодермальными, мезодермальными и энтодермальныйпроизводных (= первичное разделение), во-вторых, эти агрегаты выбираются для гемопоэтических клеток-предшественников ирасширен с факторами роста, такими как IL-3 и IL-6 (= Вторичный гемопоэтических дифференциации). Вкратце, были ЭТгенерируется в 1% метилцеллюлозы культур (1 × 104 ES клеток на 35-мм чашки Петри). Содействовать дифференциации первичнойв ЭТ ЭС клетки культивируют в дифференцировке ES среде, содержащей средой Исков модифицированной по способу Дульбекко(IMDM), 15% FCS (StemCell Technologies), 2 мМ глутамина, 150 мкМ MTG, и 40 нг / мл мышиного фактора стволовых клеток (Mscf).После 8 дней дифференциации, ЭТ собирали и промывали. 1 × 104 одиночных клеток высевали на 1%метилцеллюлозы от вторичного гемопоэтических среда дифференциации. 15% FBS, 2 мМ L-глутамат, 150 мкМ MTG, 20%BIT (10% BSA, 10 мкг / мл инсулина, 200 мкг / мл трансферрина), 150 нг / мл Mscf, 30 мкг / мл IL-3, 30 мкг / мл IL-6 и 3 ед / мл эритропоэтинабыли добавлены к культуре для повышения кроветворной дифференциации.Клетки обрабатывали для Райт-ГимзаОкрашивание, RT-PCR и Вестерн-блот анализ в разные времена дифференциации культуры Е.Б., как указано.Для определения характеристик различных типов гематопоэтические предшественники, присутствующие при ЭС клетокдифференциации ЭТ из линий ES-клетки собирали из культуры на дни 8 и 11 (от дняreplating), чтобы получить гематопоэтические предшественники. Цитоспина подготовки эти клетки окрашивали РайтГимза и исследуют под световым микроскопом. Недифференцированные клетки ES, имеют большие ядра, минимальное цитоплазмеи одного или более заметными темные ядрышки. Гемопоэтических предшественников найти в EB-14-й день культуры были определеныморфологии erythroids, мегакариоциты, моноциты / макрофаги, гранулоциты и тучных клеток, при анализе методом микроскопии.
КОНТАКТЫ VIA; walsomlab@gmail.com
ХемотаксисаХемотаксис анализы проводили с использованием 5 мкм, размер пор и 6,5 мм в диаметре Transwells Costar (Corning Costar-,Cambridge, MA), как описано ранее [30]. Клетки дважды промывали сбалансированным солевым раствором Хенка (HBSS)среда, ресуспендировали в 100 мкл среды [средний Исков, модифицированной Дульбекко (IMDM) плюс 0,5% БСА] и помещены вВерхняя палата Transwells. В нижней камере 600 мкл среды с или без лиганда был помещен, какуказано. После 4 часов инкубации при 37 ° С и 5% СО 2, верхнюю камеру удаляли и количество мигрировавшихклетки определяли с помощью CASY / TTC Счетчик клеток. Лиганда Δ9-THC (Δ9-тетрагидроканнабинол) и эндогенныхлиганд 2-AG (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI, каталог # 62165) добавляли при концентрации 1 мкМ в СМИ IMDM.
конкретных агонистов рецепторов CB2 JWH-015 (Tocris Каталожный номер # 1341) был также проверен на 1 мкМ концентрации.
CB1 специфический ингибитор AM251 (1 мкМ) (Tocris Каталожный номер # 1117) и CB2 специфический ингибитор AM630 (1 мкМ)(Tocris Каталожный номер # 1120) были использованы, чтобы блокировать эффекты каннабиноидов лигандов на хемотаксис ES клетки. ДляИнгибирование исследования клетки предварительно инкубируют с ингибитором агонистов в течение 30 мин, как указано. SDF-1 альфа (25нг / мл) использовали в качестве положительного контроля (PeproTech Инк, номер по каталогу № 250-20A).Выживание анализы2 × 104 Роза ЭС клетки (на лунку 96 лунок), CB1 и CB2 специфическими лигандами, а также ингибиторы были добавленыклеточной культуры, как указано. 1 мкМ конечную концентрацию был использован для CP55940 (CB1 и CB2 агонисты), ACEA (CB1лиганд) и JWH133 (CB2 лиганд). 1 мкМ конечную концентрацию оба AM251 (CB1 ингибитор) и AM630 (CB2 ингибитор)была использована, как указано. Клетки инкубировали в течение двух дней в увлажненной атмосфере СО2. МТТ былвыполняться в соответствии с Promega ручной (Promega Cat # G5421) и поглощение при 490 нм был записан.Endocannabinoid уровней в эмбриональных стволовых клеткахПроцедуры экстракции для калибровочных стандартов проводили, как описано [31]. Cells (ЭСК клетки ЭТ в7 день и ЭТ на 14 день) в различных концентрациях, как указано, гомогенизировали в холодном ацетоне: PBS, рН 7,4(31). Гомогената обрабатывали ультразвуком в течение 30 секунд перед центрифугированием при 20800 г в течение 5 минут. Ацетономиз полученной надосадочной жидкости удалены в атмосфере азота. К оставшемуся супернатанта добавляли 50 мкл PBS, один объемметанола и двумя объемами хлороформа для жидкостно-жидкостной экстракции липидов. Две фазыотделяли центрифугированием и нижний органический слой выпаривают в токе азота. Образцы клеток быливосстанавливали в 50 мкл этанола.Система, используемая для анализа было TSQ Квантовая Ультра тройной квадрупольный масс-спектрометр (Thermo Electron, Сан-Jose, CA) с Agilent 1100 HPLC на переднем конце (Agilent Technologies, Wilmington, DE). В качестве подвижной фазы
КОНТАКТЫ VIA; walsomlab@gmail.com
состояла из 10 мМ ацетата аммония (рН 7,3, использу гидроокись аммони; А) и 100%-ным метанолом (B). Разделение каждойаналита была достигнута с помощью Zorbax SB-CN 2,1 × 50 мм, 5 мкм, 80A, столбец (Agilent Technologies), и градиентное элюирование;пробоотборником смесь выдерживали при 4 ° С для предотвращения деградации аналита. Элюированный пиков с помощью ионизированного атмосферногоДавление химической ионизации (APCI) и обнаружены SRM переход каждого аналитов.Статистический анализРезультаты представлены как среднее ± стандартное отклонение Значимость данных определялся двусторонний тест T.P <0,05 рассматривалось как статистически значимое.Источник, графиков и рисунков: экспрессию и функцию рецепторов каннабиноидов CB1 и CB2 и их родственнымиЛигандов каннабиноидных в мышиных эмбриональных стволовых клеток
